GSK-3β在斑马鱼脑缺氧/复氧损伤中的作用及其对微管相关蛋白2的影响

目的探究斑马鱼脑缺氧/复氧(H/R)过程中糖原合酶激酶3β(GSK-3β)的作用及其对微管相关蛋白2(MAP2)的影响。方法建立斑马鱼H/R模型,选用健康同等体型成鱼,分为对照(Control)组、缺氧/复氧(H/R)组、缺氧/复氧+GSK-3β抑制剂(H/R+TDZD-8)组进行实验。选取各组斑马鱼脑组织,通过qRT-PCR测定缺氧诱导因子Hif-1αa、Hif-1αb在不同复氧时间点mRNA表达情况,TTC染色与TUNEL染色检测脑梗死面积及细胞凋亡,Western blot检测Hif-1α、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser 9)、MAP2的蛋白表达水平,免疫荧光染色检测MAP2在脑中的分布和表达情况。结果与Control组相比,H/R组Hif-1αa、Hif-1αb的mRNA及Hif-1α蛋白表达水平升高(P<0.01),脑梗死面积及凋亡细胞增多(P<0.01),p-GSK-3β(Ser 9)/GSK-3β比值、MAP2蛋白表达降低(P<0.05),MAP2免疫荧光表达下降(P<0.01);与H/R组比较,TDZD-8预处理能够减少斑马鱼脑梗死面积及细胞凋亡(P<0.01),增加p-GSK-3β(Ser 9)/GSK-3β比值、MAP2蛋白表达(P<0.01),增加MAP2免疫荧光表达(P<0.01)。结论缺氧/复氧可造成斑马鱼脑神经元损伤,其机制可能与抑制GSK-3β磷酸化和MAP2的表达有关。GSK-3β特异性抑制剂TDZD-8可通过促进p-GSK-3β(Ser 9)的表达,减少MAP2的降解,从而逆转缺氧/复氧对斑马鱼脑神经元的损伤。

预吸氧对大鼠缺氧复氧性脑损伤影响的研究

目的探讨预吸氧对大鼠缺氧复氧性脑损伤的影响及其机制。方法49只雄性Wistar大鼠随机分为7组,应用Western印迹、免疫组化和黄嘌呤氧化酶法检测在50%和100%预吸氧30min后缺氧(5%O2,30min)复氧(100%O2,1或6h)后大鼠脑皮质内NF-κB、iNOS和Mn-SOD的表达情况,同时用病理组织学方法观察脑组织损伤程度。结果与对照组相比,NF-κB的表达在100%预吸氧缺氧复氧1h组的表达显著增加(P<0.05),而50%预吸氧缺氧复氧1h组表达显著降低(P<0.01),50%预吸氧缺氧复氧6h组最低(P<0.01);与缺氧复氧1h组相比,NF-κB的表达在50%预吸氧缺氧复氧1h组显著降低(P<0.01);与缺氧复氧6h组相比,NF-κB的表达在50%预吸氧缺氧复氧6h组显著降低(P<0.01)。100%预吸氧缺氧复氧1h(P<0.05)和6h(P<0.01)两组的iNOS阳性细胞数显著高于对照组。与对照组相比,各组Mn-SOD的活力均显著增加(P<0.05或P<0.01)。与缺氧复氧1h组相比,50%预吸氧缺氧复氧1h组Mn-SOD的活力显著增加(P<0.05)。病理表现为:50%预吸氧缺氧复氧组的损伤与缺氧复氧组无明显差别,而100%预吸氧缺氧复氧组病理改变加重。结论50%预吸氧可能改善缺氧复氧性脑损伤程度,而100%浓度预吸氧可加重缺氧复氧性脑损伤程度。

异丙酚、咪达唑仑和硫喷妥钠对大鼠缺氧复氧性脑损伤的影响

为对比观察异丙酚、咪达唑仑和硫喷妥钠对大鼠缺氧复氧脑损伤的保护作用,将Wistar大鼠40只随机分为5组,每组8只,A组:对照组;B～E组:缺氧复氧组,其中C、D、E组:分别给予异丙酚、咪达唑仑和硫喷妥钠。采用酶联免疫吸附法检测大鼠脑组织8-异前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)水平,硝酸还原法测定其一氧化氮合酶(NOS)活力和NO含量。结果表明,缺氧复氧后,B、C、D、E各组脑组织中8-iso-PGF2α水平明显升高,而NOS活力和NO含量则明显降低,与A组比较差异有显著意义(P<0.05);C组和D组的脑组织8-iso-PGF2α含量较B组明显降低(P<0.05),但仍然高于A组(P<0.05),NOS活力和NO含量较B组明显升高(P<0.05)但仍然低于A组(P<0.05);D、E组的脑组织8-iso-PGF2α含量明显高于C组(P<0.05),NOS活力和NO含量明显低于C组(P<0.05);D组与E组比较,E组的脑组织8-iso-PGF2α含量明显高于D组(P<0.05),NOS活力和NO含量明显低于D组(P<0.05),但与B组相比无意义(P>0.05)。结论:异丙酚和咪达唑仑能明显降低缺氧复氧后脑组织的8-iso-PGF2α水平,提高内源性NO生成,提示对大鼠缺氧复氧脑损伤有明显的保护作用,且异丙酚的脑保护效应强于咪达唑仑,而硫喷妥钠的脑保护作用不明显。

人参银杏复方制剂对缺氧复氧后大鼠海马CA1区Fos表达的影响

目的:观察人参银杏复方制剂对缺氧24h复氧后不同时段Fos表达时程变化的影响,探讨人参银杏复方制剂抗缺氧复氧性脑损伤机制。方法:35只清洁级SD大鼠随机分为常氧对照组,缺氧复氧实验组和人参银杏复方制剂给药组。应用低压氧舱仿海拔8000m高空缺氧模型,采用Nissl染色、Fos免疫组化方法结合图像分析技术,观察预防性应用人参银杏复方制剂对缺氧24h复氧0,24,72h不同时段海马CA1区锥体细胞层神经元形态及Fos免疫反应阳性神经元的影响。结果:全脑缺氧24h复氧72h后,海马CA1区锥体细胞层神经元数量锐减,Fos免疫反应阳性神经元数量在缺氧24h复氧0h时为(9.3±3.8)个,较常氧对照组(16.6±4.8)个减少,差异有显著性意义(P<0.05),复氧24h时显著减少甚至消失为(2.0±1.8)个,复氧72h为(13.7±5.1)个,时接近常氧对照组水平差异无显著性意义(P>0.05)。预防性应用人参银杏复方制剂后缺氧24h复氧72h时海马CA1区锥体细胞层神经元数量未见明显减少,在缺氧24h复氧0,24,72h时段CA1区Fos免疫反应阳性神经元数量分别较缺氧复氧实验组相应时段增加,以复氧0h时增加最为显著,为(39.0±5.8)个,与常氧对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:人参银杏复方制剂对缺氧复氧后海马CA1区神经元具有保护作用。

大鼠缺氧复氧性损伤中热休克蛋白70的表达及预吸氧的效应

为探讨缺氧复氧性脑损伤中热休克蛋白70(HSP 70)的表达及预吸氧的效应,将成年雄性Wistar大鼠72只随机分为4组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),每组又分成3个亚组(a、b、c),各亚组6只。Ⅰa、Ⅱa、Ⅲa、Ⅳa组,分别吸入21%、50%、75%及95%O_2 30min;Ⅰb、Ⅱb、Ⅲb、Ⅳb组,在预吸氧后分别给予5%O_2缺氧20min;Ⅰc、Ⅱc、Ⅲc、Ⅳc组,在预吸氧、缺氧后,给予98%以上O_2复氧20min。实验结束后48h将动物处死,取脑组织,应用病理学方法、免疫组化技术和Western印迹技术,观察损伤程度及HSP70的表达。结果表明,高浓度预吸氧后(Ⅲ、Ⅳ组)神经元轻度水肿;缺氧后各组神经元损伤加重;复氧后各组损伤进一步加重,Ⅱc组损伤轻于其它各组。与预吸氧组(a组)相比,缺氧组(b组)HSP70的表达显著增高,复氧组(c组)则较缺氧组(b组)减少(P<0.01);高浓度的预吸氧组(Ⅲ、Ⅳ组)在缺氧复氧时HSP70表达低于对照组(Ⅰ组);而较低浓度预吸氧组(Ⅱ组)HSP70表达高于对照组(P<0.01)。结论:较低浓度预吸氧可增强脑细胞的抗氧化损伤能力,减轻缺氧复氧性脑损伤。HSP70表达增加可能是低浓度预吸氧增强机体抗氧化损伤能力的机制之一。

急性低氧条件下复氧后大鼠脑HIF-1α、nNOS蛋白的表达与人参皂甙Rd干预

目的观察大鼠脑缺氧状态下缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、神经元性一氧化氮合酶(nNOS)蛋白的表达规律及低氧状态下人参皂甙Rd(Rd)干预对其影响并探讨机理。方法将成年Wistar大鼠120只随机分为3组:①急性低氧组(对照组);②低氧预处理组(低氧干预组);③人参皂甙Rd预处理组(药物干预组)。每组按照缺氧后不同时间点再分为4个亚组,各亚组10只大鼠,分别观察各组大鼠海马锥体细胞层神经元形态的变化及HIF-1α、nNOS蛋白的表达规律。结果在缺氧后复氧即刻,我们可以发现HIF-1α、nNOS蛋白的少量表达,主要存在于海马细胞,多在细胞质中表达;随着时间的推移,在复氧后4 h,HIF-1α、nNOS表达渐达高峰,至复氧后9h HIF-1α表达明显减少,而nNOS表达至复氧后24 h明显减少。低氧预处理组及人参皂甙Rd预处理组的实验结果发现HIF-1α、nNOS表达较对照组减少,与急性低氧组各时间点相比,均有统计学意义(P=0.009)。两个干预组之间各时间点比较无统计学差异(P>0.05)。结论急性低氧可以促使HIF-1α、nNOS蛋白在大鼠海马神经细胞的表达,具有时间依赖性;同时低氧预处理及人参皂甙Rd预处理均可促使大鼠脑组织HIF-1α、nNOS表达减少,可能对急性缺氧性脑损伤产生保护作用,其具体机理可能与其抗自由基。

急性低氧条件下复氧后大鼠脑HIF-1α蛋白的表达与人参皂甙Rd干预研究

目的观察大鼠脑缺氧状态下缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白的表达及低氧状态下人参皂甙Rd干预对其影响。方法将成年Wistar大鼠90只随机分为急性低氧对照组、低氧预处理干预组、人参皂甙Rd预处理干预组,每组按缺氧后不同时间点(复氧后0h、4h、9h)再分为3亚组,每组10只大鼠。采用免疫组化法检测HIF-1α蛋白的表达。结果在缺氧后复氧即刻,HIF-1α蛋白少量表达,主要存在于海马细胞;随着时间的推移,在复氧后4h,HIF-1α表达逐渐达高峰,至9h时HIF-1α表达又明显减少。低氧预处理干预组及人参皂甙Rd干预组的实验结果发现HIF-1α表达较急性低氧对照组减少,与急性低氧对照组各时间点相比,差异均有显著性(P<0.05)。两个干预组之间比较无统计学差异。结论急性低氧可以促使HIF-1α在大鼠海马神经细胞的表达,具有时间依赖性,低氧预处理干预及人参皂甙Rd干预均可促使大鼠脑组织HIF-1α表达减少。

预吸氧对大鼠缺氧/复氧性脑损伤时脑皮质血红素氧合酶-1/一氧化氮通路的影响

目的 观察预吸氧对大鼠缺氧/复氧性脑损伤脑皮质血红素氧合酶-1（HO-1）/一氧化氮（NO）通路的影响.方法 在大鼠脑缺氧复氧前30 min预吸氧30 min,测定大脑皮质HO-1蛋白表达、NO含量和超微结构的变化.结果 大鼠缺氧/复氧后大脑皮质有所损伤,表现为HO-1蛋白表达增加[（0.65±0.18）％增加到（10.50±1.83）％]、NO含量增加[（2.03±0.28） μmol/mg蛋白增加到（5.50 ±0.52） μmol/mg蛋白]和超微结构变化,预吸氧可显著加重这种损伤,HO-1蛋白表达南[（10.50±1.83）％降低到（7.14±1.35）％],NO含量由[（5.50±0.52）μmol/mg蛋白增加到（7.89±0.20）μmol/mg蛋白].结论 预吸氧可加重缺氧复氧性脑损伤,其机制与抑制HO-1蛋白表达及增加NO含量有关.

小檗碱对脑缺氧-复氧大鼠内质网应激通路的作用机制研究

目的探讨小檗碱对脑缺氧-复氧大鼠内质网应激通路的作用机制。方法选择30只成年Sprague Dawley大鼠(200~250 g)按照随机数字表法平均分为对照组、缺氧-复氧组和小檗碱处理组,每组10只。缺氧-复氧组及小檗碱处理组于含有5%氧气的缺氧箱中缺氧处理30 min后立即转入含有100%氧气的复氧箱中复氧处理6 h后取出,建造脑缺氧-复氧模型。对照组在同等大小箱子内同等时间通入空气处理。小檗碱处理组大鼠取出2 h后,灌胃给予浓度为200 mg/(kg·day)小檗碱,对照组和缺氧-复氧组大鼠灌胃给予同等剂量生理氯化钠溶液,连续灌胃7 d,麻醉后断头取全脑进行实验。采用氯化三苯四氮唑(TTC)染色法对各组大鼠的脑梗死体积进行测算,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)染色检测细胞凋亡。通过ELISA检测白细胞介素(IL-6)和IL-10水平检测脑组织炎症反应。蛋白印迹检测细胞介素受体拮抗剂(IL-1Ra)和IL-1β的蛋白水平。结果缺氧-复氧组脑梗面积大于对照组(P<0.01)。小檗碱处理组脑梗面积小于缺氧-复氧组(P<0.01)。小檗碱处理组脑组织细胞凋亡低于缺氧-复氧组(P<0.01)。与对照组比较,缺氧-复氧组脑组织IL-6水平上升,IL-10水平降低(P<0.01)。与对照组比较,缺氧-复氧组脑组织IL-6水平和IL-1Ra/IL-1β比值上升,IL-10水平降低(P<0.01)。与缺氧-复氧组比较,小檗碱处理组脑组织IL-6水平和IL-1Ra/IL-1β比值下降,IL-10水平升高(P<0.01)。结论小檗碱可缓解脑缺氧-复氧大脑脑梗面积,神经元凋亡及免疫炎症反应,其可以抑制脑缺氧-复氧引起的内质网应激通路。

低温对二氮嗪预处理减轻大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的作用

脑缺血再灌注损伤是一个多因素、多环节的恶性级联过程，针对不同环节发挥作用的保护措施联合应用比单一保护措施更有效。低温简单易行，安全范围大，是当前较为重要的脑保护措施，但低温并不能完全消除脑损伤。有研究表明，选择性线粒体内膜ATP敏感性钾通道（Mito-KATP）开放剂二氮嗪可减轻缺氧复氧性脑损伤。但低温对二氮嗪预处理减轻大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的作用尚需进一步探讨。本研究拟观察低温对二氮嗪预处理减轻大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的作用，为临床研究提供理论依据。