温阳复元方通过调控miRNA-137/线粒体铁死亡通路保护大鼠脑缺血再灌注损伤机制研究

目的探讨温阳复元方对miRNA-137/线粒体铁死亡通路的调控作用,阐明该方对脑缺血再灌注损伤(CIRI)的神经保护作用机制。方法线栓法制备大鼠CIRI模型,将144只SD大鼠随机分为假手术(SO)组、模型(I/R)组、补阳还五汤对照(BYHW)组、温阳复元方(WYFY)组、温阳复元方+miRNA-137模拟物(WYFY+mimic)组、温阳复元方+miRNA-137抑制物(WYFY+Inhibitor)组,每组按再灌注时间点分为3个亚组。采用Zea-Longa评分法进行神经功能缺损评分(NFS);TTC染色测量脑梗死体积;qRT-PCR和Western blot法观察miRNA-137、膜铁转运蛋白(FPN)和二价金属离子转运体1(DMT1)的mRNA及其蛋白表达水平。结果(1)NFS结果:I/R组NFS较SO组显著增加(P<0.01),与I/R组相比,BYHW组NFS仅在12 h时评分降低(P<0.05),而WYFY组在24 h和3 d的NFS明显降低(P<0.05或P<0.01),WYFY+mimic组NFS显著下降(P<0.01),WYFY+Inhibitor组在3 d时NFS降低(P<0.05);与WYFY组相比,WYFY+mimic组NFS仅在12 h时明显降低(P<0.05)。(2)TTC染色结果:I/R组梗死体积较SO组显著增大(P<0.01),BYHW组和WYFY组较I/R组明显减小(P<0.05或P<0.01),WYFY组梗死体积较BYHW组进一步减小(P<0.01);相较于WYFY组,WYFY+mimic组能进一步减小其梗死体积(P<0.05),而WYFY+Inhibitor组梗死灶明显增大(P<0.05)。(3)miRNA-137 mRNA表达水平:I/R组miRNA-137mRNA的表达较SO组显著下降(P<0.01),WYFY治疗后其表达量显著增加(P<0.01),且WYFY组其表达水平较BYHW组进一步增高(P<0.01);与WYFY组同期比较,WYFY+mimic组miRNA-137 mRNA表达量均进一步升高(P<0.01),WYFY+Inhibitor组抑制该表达(P<0.01)。(4)FPN mRNA及蛋白表达水平:I/R组FPN mRNA和蛋白表达水平较SO组均降低(P<0.01),WYFY组能显著增加其表达(P<0.01),该组在12 h和3 d时的表达量较BYHW组进一步增加(P<0.05或P<0.01);与WYFY组同期对比,WYFY+mimic组其表达水平在24 h及3 d时增加(P<0.01),而WYFY+Inhibitor组其表达水平均降低(P<0.01)。(5)DMT1 mRNA及蛋白表达水平:I/R组DMT1mRNA和蛋白表达量较SO组均显著增加(P<0.01);与I/R组比较,WYFY能降低其表达水平(P<0.01),且WYFY组在3 d时其表达量较BYHW组进一步降低(P<0.05);与WYFY组同期相比,WYFY+mimic组其表达水平在24 h和3 d时均降低(P<0.01),而WYFY+Inhibitor组其表达水平均显著增加(P<0.01)。结论温阳复元方可能通过上调miRNA-137的表达,进而上调铁转运蛋白FPN的表达,下调DMT1的表达,调节铁代谢,最终抑制线粒体铁死亡,发挥其神经保护作用,其疗效优于补阳还五汤。

基于miR-21探讨针刺对PI3K/AKT信号通路脑缺血再灌注大鼠脑区星形胶质细胞影响

目的 观察电针对激活脑缺血再灌注(cerebralischemia reperfusion injury,CIRI)大鼠脑组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路和星形胶质细胞(astrocyte,AS)表达影响,进而调控神经发生过程,以及microRNA-21(miR-21)在此过程中的作用。方法 选取SD级别雌性大鼠18只,应用随机数字表法将其分成3组,即假手术组、模型组、电针组,每组6只。除假手术组外,其他两组采用Longa改良线栓法建立大鼠CIRI模型,评定造模成功后,电针组给予电针治疗,其他两组不做处理。采用动物神经功能评分(Longa评分)及神经行为学测试(Morris水迷宫实验)对各组大鼠进行评定。应用HE染色观察脑组织病理改变,免疫荧光法检测各组星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达情况,实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(Real-time PCR,RT-PCR)法检测各组星形胶质细胞miR-21表达情况,蛋白免疫印迹(Western blot,WB)法检测各组星形胶质细胞胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、苏氨酸蛋白激酶(AKT)蛋白表达情况。结果 (1)Longa评分结果:治疗后电针组大鼠Longa评分降低,与假手术组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)Morris水迷宫实验结果:与假手术组比较,模型组大鼠穿越逃生平台次数减少(P<0.05);治疗后电针组较模型组穿越逃生平台次数显著增加(P<0.05)。(3)脑组织病理切片结果:电针组大鼠脑组织损伤情况缓解最为显著。(4)免疫荧光检测结果:电针组较模型组星形胶质细胞数量增多(P<0.05),模型组较假手术组PPARγ阳性表达减弱(P<0.05),电针组较模型组PPARγ阳性表达增多(P<0.05)。(5)RT-PCR检测结果:与假手术组比较,模型组miR-21表达增多(P<0.05),电针组较模型组表达增多更为显著(P<0.05)。(6)WB检测结果:模型组PI3K、AKT蛋白表达较假手术组增多(P<0.05)。电针治疗干预后,与模型组相比,电针组PI3K、AKT蛋白表达增多更为显著(P<0.05)。结论电针治疗可上调PPARγ表达,活化miR-21激活PI3K/AKT信号通路表达,保护因脑缺血再灌注导致损伤的神经元,使其修复与再生,以降低脑缺血再灌注带来的不良影响。

MiRNA调控脑缺血/再灌注诱导的自噬信号通路研究进展

脑卒中时缺血缺氧致脑组织功能损伤,且缺血后脑组织再恢复血液供应时,大量自由基、钙超载等引起脑缺血/再灌注损伤,进一步加重病情。自噬是一种维持细胞内环境稳态的自我保护机制,但过度自噬引起脑组织损伤。MiRNA为小的内源性非编码RNA分子,通过与其靶基因mRNA的3’-UTR中的互补序列结合,导致翻译抑制或mRNA降解,从基因水平上调控多种生理活动。MiRNA不仅直接作用于自噬相关蛋白,还可通过多种信号通路,参与缺血/再灌注诱导的自噬调控。但关于miRNA调控脑缺血/再灌注诱导的自噬信号通路尚缺乏系统性归纳与分析。本文综述了miRNA-124、miRNA-298、miRNA-202-5p、miRNA-142以及miRNA-26b等miRNA通过不同信号通路调控脑缺血/再灌注中的细胞自噬,为脑卒中的自噬研究提供了系统的理论思路。

miR-29c-5p通过上调LRP6调控铁死亡减轻脑梗死缺血再灌注损伤

目的:探究miR-29c-5p在脑缺血-再灌注损伤中调控铁死亡的机制。方法:在这项研究中,雄性SD大鼠接受大脑中动脉闭塞(MCAO)手术,随后恢复血液流动。采用神经功能评分和TTC染色来评估脑组织损伤和梗死体积。采用qPCR方法检测miR-29c-5p的相对表达水平。通过Western Blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)、低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)的表达水平。采用相应的检测试剂盒检测GSH、Fe和丙二醛(MDA)的含量,并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-29c-5p的靶基因。结果:随着大鼠缺血再灌注时间的增加,miR-29c-5p的相对表达水平升高,铁死亡加重。此外,agomiR-29c-5p干预也加重了脑组织损伤和铁死亡,而antagomiR-29c-5p干预则使这些影响得到逆转。此外,agomiR-29c-5p和Fer-1联合干预可减轻脑组织损伤和铁死亡。双荧光素酶报告基因实验结果表明,LRP6是miR-29c-5p的靶基因。结论:在本研究中,miR-29c-5p通过负调控LRP6促进铁死亡进而加重大鼠脑缺血-再灌注损伤。

银杏双黄酮对大鼠脑缺血再灌注损伤时局部微血管及神经功能缺损的影响

目的:探讨银杏双黄酮对脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)所致神经功能损伤和血管新生的影响及潜在机制。方法:60只SD大鼠随机分为假手术组、I/R模型组、银杏双黄酮(40 mg/kg)处理组,每组20只。采用大脑中动脉闭塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)大鼠模型模拟脑I/R,且在再灌注后连续注射银杏双黄酮7 d。TTC染色测定各组大鼠脑梗死体积。通过尼氏染色和神经元特异性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)免疫组织化学分析各组大鼠缺血半暗带中的神经元密度。CD31标记法与BrdU/血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)双标免疫荧光染色法分析各组大鼠缺血半暗带中微血管密度和血管新生情况。Western blot检测各组大鼠缺血半暗带中热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的水平。结果:与I/R模型组比较,银杏双黄酮处理组脑梗死体积显著变小(P<0.01),缺血半暗带中神经元、微血管密度和血管新生以及HIF-1α、VEGF和HSP70表达水平显著增高(P<0.01)。结论:银杏双黄酮能促进MCAO大鼠血管新生和神经功能恢复,并上调缺血半暗带中HSP70、VEGF和HIF-1α的表达。

肝缺血再灌注对幼鼠血脑屏障通透性及脑组织细胞凋亡的影响

目的观察肝缺血再灌注(HIR)对幼鼠血脑屏障(BBB)通透性及脑组织细胞凋亡的影响。方法将24只健康清洁级C57BL/6幼鼠随机分为假手术组、右旋糖苷10组和右旋糖苷40组,每组8只。右旋糖苷10组、右旋糖苷40组均采用夹闭肝左动脉及门静脉共干的方法建立HIR模型,于再灌注60 min后经下腔静脉注射相对分子质量分别为10、40 kD的右旋糖苷,假手术组组仅行开关腹、游离血管等操作。采用免疫荧光染色观察脑组织BBB通透性(以右旋糖苷通过率表示),采用Western blotting法检测脑组织BBB紧密连接蛋白相关指标闭合蛋白(Claudin)、咬合蛋白(Occludin)、β-连环蛋白(β-Catenin)、紧密连接蛋白1(ZO-1)相对表达量,采用TUNEL法检测脑组织细胞凋亡率。结果与假手术组比较,右旋糖苷10组、右旋糖苷40组幼鼠脑组织右旋糖苷通过率、细胞凋亡率均升高,且右旋糖苷10组右旋糖苷通过率更高(P均<0.05)。与假手术组比较,右旋糖苷10组、右旋糖苷40组幼鼠脑组织Claudin、Occludin、β-Catenin、ZO-1蛋白相对表达量均降低(P均<0.05),右旋糖苷10组、右旋糖苷40组上述指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论HIR会导致幼鼠BBB通透性增加、脑组织细胞凋亡增多。

长链非编码RNA在脑缺血再灌注损伤炎症反应中研究进展

脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI)是指脑缺血后再恢复血流时导致神经功能缺损症状进一步加重的现象,严重影响患者的预后。近年来研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)与CIRI后的炎症反应密切相关。从CIRI的机制出发,对近年来发现的影响CIRI炎症反应中LncRNA的表达及其作用机制做一总结,旨在为CIRI的治疗提供新的治疗靶点和研究思路。

醒神通督针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬的作用研究

目的从自噬探讨醒神通督针刺抗脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注模型组(简称模型组)和脑缺血再灌注+醒神通督针刺组(简称针刺组)。采用大脑中动脉线栓法构建脑缺血再灌注损伤模型,针刺组大鼠造模前5 d开始干预,取穴“百会”“四神聪”“足三里”,每日针刺1次,直至再灌注24 h。另外2组大鼠只抓取不针刺。再灌注24 h后采用氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色观察脑梗死面积,透射电镜观察神经元及自噬的亚显微结构,Western blot、免疫荧光检测缺血皮层微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein light chain 3B,LC3)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(coiled coil moesin like BCL2 interacting protein,Beclin-1)、自噬相关蛋白(autophagy related protein,Atg)12、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)与磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p-Akt)的表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠大脑中动脉供血区梗死面积明显增加(P<0.05),且缺血皮层神经元结构严重破坏,自噬明显激活,自噬蛋白Beclin-1、Atg12表达及LC3Ⅱ/I比值显著升高(P<0.05),p-Akt表达下降(P<0.05)。与模型组比较,针刺组大鼠脑梗死面积减少(P<0.05),透射电镜显示神经元结构较为正常,自噬体较少。此外,针刺组自噬蛋白Beclin-1、Atg12表达及LC3Ⅱ/I比值明显降低(P<0.05),p-Akt表达显著上调(P<0.05)。结论针刺具有抗脑缺血再灌注损伤作用,可能通过抑制自噬的活化实现。

基于UCP2信号研究丙泊酚对脑缺血/再灌注大鼠小胶质细胞极化的影响

目的探讨丙泊酚对脑缺血/再灌注(I/R)大鼠解耦联蛋白(UCP)2信号及小胶质细胞极化的影响。方法60只SD大鼠随机分为假手术组,模型组,丙泊酚低、中、高(5、15、25 mg/kg)剂量组,每组12只。采用Longa线栓法缺血2 h,再灌注24 h建立大鼠I/R模型,脑缺血期间腹腔注射丙泊酚治疗,再灌注24 h后评估大鼠神经功能。处死大鼠,取脑组织,采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测脑梗死体积;酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测大鼠脑脊液中炎性细胞因子含量;免疫组化染色分析大鼠小胶质细胞活化;实时荧光定量PCR检测M1/M2型小胶质细胞标志物mRNA含量;Western印迹测定UCP2、p-核转录因子(NF)-κB、NOD样受体热蛋白结构域样蛋白(NLRP)3含量。结果与假手术组相比,模型组神经功能评分、脑梗死体积、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量、离子钙结合接头分子(iba)1表达、促炎性M1表型小胶质细胞标志物mRNA、p-NF-κB、NLRP3含量均明显增加(P<0.05),但UCP2表达明显减少(P<0.05)。与模型组相比,丙泊酚低、中、高剂量组神经功能评分、脑梗死体积、IL-1β、IL-6、TNF-α含量,iba1表达、促炎性M1表型小胶质细胞标志物mRNA、p-NF-κB、NLRP3含量呈剂量依赖性减少(P<0.05),IL-10含量、抗炎性M2表型小胶质细胞标志物mRNA与UCP2含量呈剂量依赖性增加(P<0.05)。结论丙泊酚可通过调节UCP2表达,抑制小胶质细胞M1表型极化,促进M2表型极化,减少炎性细胞因子的释放与脑梗死体积,改善神经功能损伤。

人参皂苷Rc通过调控AMPK通路介导的细胞焦亡减轻小鼠脑缺血再灌注损伤

目的:探讨人参皂苷Rc对脑缺血再灌注损伤(CIRI)小鼠的保护作用,并从细胞焦亡角度阐释其作用机制。方法:将C57BL/6小鼠随机分为假手术(sham)组、大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)组、人参皂苷Rc+MCAO/R组(Rc组)、AMP活化蛋白激酶(AMPK)激动剂阿卡地新(AICAR)+MCAO/R组(agonist组)和人参皂苷Rc+MCAO/R+AMPK抑制剂Compound C组(Rc+inhibitor组)。对agonist组小鼠给予AICAR(500 mg/kg)腹腔注射,Rc+inhibitor组小鼠给予Compound C(20 mg/kg)腹腔注射;Rc组和Rc+inhibitor组小鼠造模后给予人参皂苷Rc(40 mg/kg)灌胃,每天一次,连续7 d;sham组和MCAO/R组则给予等体积的纯化水。Zea Longa评分观察小鼠神经功能缺损程度,TTC染色观察小鼠脑梗死体积,干湿重法观察小鼠脑水肿程度,HE染色观察小鼠脑组织病理形态的改变,RT-qPCR和Western blot检测小鼠脑组织AMPK、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(caspase-1)和焦亡效应蛋白消皮素D(GSDMD)的表达,ELISA检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18的含量。结果:Rc组和agonist组小鼠神经功能缺损症状减轻,脑梗死体积减小,脑水肿和神经元病理损伤受到抑制,脑组织pAMPK/AMPK比值和AMPK mRNA表达水平升高,细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1和GSDMD的mRNA和蛋白表达水平降低,炎症因子IL-1β和IL-18表达水平降低。Rc+inhibitor组小鼠脑组织p-AMPK/AMPK比值和AMPK mRNA表达水平较Rc组显著下降(P<0.05),NLRP3、caspase-1和GSDMD的mRNA和蛋白表达水平,以及IL-1β和IL-18表达水平显著升高(P<0.05),小鼠神经功能缺损程度评分升高,脑梗死体积增大,脑水肿和神经元病理损伤显著加重(P<0.05)。结论:人参皂苷Rc可能通过活化AMPK通路抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡,从而减轻小鼠CIRI。

急性脑缺血/再灌注损伤后神经元细胞骨架蛋白的动态变化

目的探讨急性脑缺血/再灌注大鼠神经元细胞骨架蛋白时空动态变化。方法线栓法阻断大鼠大脑中动脉90 min后实现再灌注,在不同再灌注时间点观察及取材。尼氏染色观察神经细胞损伤,采用神经功能缺损评分和前肢放置实验评估神经功能;免疫组化染色、免疫印迹法观察细胞骨架成分微管相关蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)、神经丝重链(neurofilament heavy chain,NF-H)的变化;透射电镜观察轴突、树突和神经丝亚显微结构。结果随着再灌注时间的延长,脑损伤和神经行为功能损害逐渐加重。纹状体损伤比皮层出现的更早、更严重。缺血区域的MAP2相关免疫反应强度降低,NF-H相关免疫反应强度升高。超微结构观察显示细胞骨架排列受损,密度降低。结论不同脑区对缺血/再灌注损伤的耐受性不同。神经元细胞骨架的主要成分对缺血和再灌注表现出动态反应,这可能进一步促进脑损伤和神经功能缺损。

二甲双胍对小鼠脑缺血再灌注损伤后认知功能的影响及其机制

目的探讨二甲双胍对脑缺血再灌注(I/R)小鼠认知功能的影响及其机制。方法采用随机数字表法将40只雄性C57BL/6小鼠[(23±2)g,7~8周龄]分为4组:sham组、I/R组、I/R+100 mg/kg二甲双胍组(低剂量组)和I/R+200 mg/kg二甲双胍组(高剂量组),每组10只。脑缺血组小鼠采用大脑中动脉阻断(MCAO)60 min后再灌注7 d,sham组除不插入细丝阻断外,其余手术步骤相同;低剂量组和高剂量组小鼠在脑缺血再灌注后4 h,每天分别用100,200 mg/kg二甲双胍溶液灌胃,持续7 d。采用Morris水迷宫实验评价小鼠学习和记忆相关指标;采用干湿质量法评估小鼠脑水肿情况;采用HE染色评估小鼠神经元形态变化;采用ELISA试剂盒检测小鼠脑组织脑源性神经营养因子(BDNF)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与sham组相比,I/R组小鼠自发交替正确率降低,逃避潜伏期增加,目标象限时间降低,穿越平台次数降低(均P<0.05);脑组织含水量增加(P<0.05);BDNF含量和SOD活性均降低(P<0.05);脑组织中变性神经元数量增多。与I/R组相比,低剂量组小鼠目标象限时间增加(P<0.05);高剂量组小鼠自发交替正确率增加(P<0.05),逃避潜伏期降低(P<0.05),目标象限时间增加(P<0.05),穿越平台次数增加(P<0.05),脑组织含水量降低(P<0.05),BDNF含量和SOD活性增加(P<0.05),神经元变性减少。结论200 mg/kg二甲双胍后处理可改善脑缺血再灌注小鼠认知功能,可能与脑水肿减轻、神经元变性改善、脑内BDNF含量和SOD活性增加有关。

GRSF1/GPX4轴调控的铁代谢紊乱在小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用

目的探讨GRSF1/GPX4轴调控的铁代谢紊乱在小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。方法清洁级雄性C57BL/6小鼠18只,采用随机数字表法将其分为假手术组、脑缺血再灌注组、脑缺血再灌注+GRSF1过表达组,每组各6只。脑缺血再灌注组采用线栓法制备小鼠脑缺血再灌注损伤模型;脑缺血再灌注+GRSF1过表达组于造模前7天注射GRSF1过表达慢病毒。再灌注24h后行神经功能评分,TUNEL法检测细胞凋亡率,Western blot法检测GRSF1、GPX4、IRP2、TfR1和铁蛋白表达水平。结果与假手术组比较,脑缺血再灌注组神经功能评分、凋亡率、IRP2、TfR1、铁蛋白表达水平升高,GRSF1、GPX4表达水平降低(P<0.05);与脑缺血再灌注组比较,脑缺血再灌注+GRSF1过表达组神经功能评分、凋亡率、IRP2、TfR1、铁蛋白表达水平降低,GRSF1、GPX4表达水平升高(P<0.05)。结论过表达GRSF1通过上调GPX4抑制铁离子代谢紊乱进而减轻小鼠脑缺血再灌注损伤。

亚低温通过影响ACSL4调节铁死亡改善脑缺血再灌注损伤的研究进展

脑缺血再灌注损伤是发生在脑缺血后的更加严重阶段,目前临床治疗仍以药物及手术溶栓为主。铁死亡作为一种独特的细胞死亡方式,已被证实其在脑缺血及其再灌注损伤中扮演的特殊机制,这与酰基辅酶A合成酶长链家族(ACSL4)介导脂质过氧化物的积累导致铁死亡发生有关。最近研究发现,亚低温作为临床接受的物理治疗方法,对脑缺血再灌注损伤的疗效作用可能是阻止发生脂质氧化、改善脑缺血缺氧,调节凝血酶功能及铁代谢、抑制兴奋毒性、减轻炎症及水肿、降低血脑屏障的通透性等手段,最终使得铁死亡发生沉默。本文旨在分析亚低温如何通过影响ACSL4调节铁死亡的发生,进而为脑缺血再灌注损伤的机制学研究及临床治疗提供新的途径与方法。

玄参提取物对脑缺血再灌注损伤小鼠氧化应激及炎症反应的影响

目的探讨玄参提取物对脑缺血再灌注损伤(CRI)小鼠氧化应激及炎症反应的影响。方法将60只SPF级雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为模型组、正常组、阳性对照组、低剂量组和高剂量组,每组各12只。模型组、阳性对照组、低剂量组和高剂量组建立小鼠CRI模型。建模前,低、高剂量组小鼠术前分别给予5、20 mL/kg玄参提取物灌胃;阳性对照组给予20 mL/kg辛伐他汀灌胃;模型组和正常组术前分别给予等量0.9%氯化钠注射液灌胃,均1次/d,连续5 d。采用Bederson评分法和Longa评分法评价小鼠神经功能;采用Morris水迷宫实验测定小鼠找到平台的时间(潜伏期)和穿越平台次数;采用硫代巴比妥酸比色法测定血清丙二醛(MDA)水平,采用黄嘌呤氧化酶法测定血清超氧化歧化酶(SOD)水平;采用ELISA法测定血清IL-6、IL-8和TNF-α水平;测量小鼠脑梗死体积百分比。结果与正常组比较,其他各组Bederson评分、Longa评分、MDA水平、IL-6、IL-8和TNF-α水平、脑梗死体积百分比均明显增高,而SOD水平明显降低(均P<0.05);与模型组比较,阳性对照组、低剂量组与高剂量组Bederson评分、Longa评分、MDA水平、IL-6、IL-8和TNF-α水平、脑梗死体积百分比均明显降低,而SOD水平明显增高(均P<0.05);与阳性对照组和低剂量组比较,高剂量组Bederson评分、Longa评分、脑梗死体积百分比、MDA水平、IL-6、IL-8和TNF-α水平均明显降低,而SOD水平明显增高(均P<0.05)。其他各组第1、2、3、4天潜伏期均长于正常组(均P<0.05);阳性对照组、低剂量组与高剂量组第1、2、3、4天潜伏期均短于模型组(均P<0.05);高剂量组第1、2、3、4天潜伏期均短于阳性对照组和低剂量组(均P<0.05)。结论玄参提取物对脑缺血再灌注损伤小鼠有较好的保护作用,可显著改善小鼠神经功能,明显缩小小鼠脑梗死体积,其机制可能与改善氧化应激及减轻炎症反应有关。

龙生蛭胶囊保护脑缺血再灌注损伤大鼠的作用及机制研究

目的探讨龙生蛭胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及机制。方法通过改良线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。实验分为假手术组(仅分离血管不插线栓,予同体积生理盐水)、模型组(造模,予同体积生理盐水)、尼莫地平组(阳性对照,造模,给药剂量为20 mg/kg)和龙生蛭胶囊低、中、高剂量组(造模,给药剂量依次为0.72、1.44、2.88 g/kg),每组10只。各组大鼠灌胃相应药液/生理盐水,每天1次,连续7 d。末次给药1 h后,采用Zea Longa评分法对各组大鼠的神经功能缺失情况进行评分;ABC-酶联免疫吸附试验法检测大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平;TTC染色观察大鼠脑梗死体积并计算脑梗死体积比;苏木精-伊红染色观察大鼠脑组织病理形态的变化;免疫组化法检测大鼠脑组织NLRP3蛋白阳性表达情况;实时荧光定量PCR法检测大鼠脑组织Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)mRNA表达;Western blot法检测大鼠脑组织TLR4、NLRP3、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)及细胞核内NF-κB蛋白表达情况。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺失评分,血清TNF-α和IL-6水平,脑梗死体积比,脑组织NF-κB和TLR4 mRNA的相对表达水平,以及脑组织TLR4、NLRP3、p-NF-κB蛋白的相对表达水平及其细胞核内NF-κB蛋白的相对表达水平均显著升高(P<0.01);大鼠脑组织皮层神经细胞间隙增大、水肿明显,可见大量炎性细胞浸润;大鼠脑组织中NLRP3蛋白阳性表达明显增多。与模型组比较,龙生蛭胶囊中、高剂量组及尼莫地平组大鼠以上指标水平均有不同程度逆转,大部分差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);病理形态观察结果明显好转,大鼠脑组织中NLRP3蛋白阳性表达均明显减少。结论龙生蛭胶囊可能通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,抑制神经炎症反应,从而达到对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。

基于环磷酸腺苷/蛋白激酶A/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白通路探究丙泊酚对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经功能改善机制

目的:基于环磷酸腺苷/蛋白激酶A/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP/PKA/CREB)通路探究丙泊酚对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经功能的改善机制。方法:采用改良线栓法缺血2 h,再灌注24 h建立大鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)模型,将造模成功大鼠随机分为模型组和丙泊酚低(1 mg/ml)、中(2.5 mg/ml)、高剂量(5 mg/ml)组,各12只,另设含有12只大鼠的假手术组。分组后即开始给药,1次/d,共4周,末次给药12 h后,采用改良神经功能评分(mNSS)法进行神经缺损评分;采用TTC染色法检测脑梗死面积;HE、Nissl染色进行神经元细胞及尼氏小体形态学观察;Tunel法进行神经元细胞凋亡检测;Elisa法检测脑组织cAMP、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)含量;免疫荧光法检测脑组织环磷酸腺苷(cAMP)、p-PKA、p-CREB阳性细胞数及其蛋白共表达阳性细胞数;Western blot法检测脑组织PKA、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白表达量。结果:模型组大鼠比较假手术组大鼠的mNSS评分、脑梗死面积百分比显著增加(均P<0.05),HE染色和Nissl染色可见明显的神经元细胞损伤和尼氏小体破坏,脑组织cAMP、BDNF、NGF含量和PKA、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白表达量显著下降,模型组大鼠比较假手术组大鼠的cAMP、p-PKA、p-CREB阳性细胞数和蛋白共表达阳性细胞数也明显下降(均P<0.05)。与模型组比较,丙泊酚给药组大鼠mNSS评分、脑梗死面积百分比显著降低(均P<0.05),HE染色和Nissl染色可见神经元细胞损伤和尼氏小体破坏有不同程度改善,脑组织cAMP、BDNF、NGF含量和PKA、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白表达量显著升高(均P<0.05),cAMP、p-PKA、p-CREB阳性细胞数及其蛋白共表达阳性细胞数均显著升高(均P<0.05)。结论:丙泊酚可能通过cAMP/PKA/CREB通路改善CIRI大鼠神经功能。

基于PI3K/AKT信号通路探讨针刺对脑缺血再灌注损伤模型大鼠线粒体自噬的机制研究

目的 观察针刺疗法对脑缺血再灌注损伤(CIRI)模型大鼠脑组织线粒体自噬的影响,并探究其对脑组织保护作用的机制。方法 40只SD大鼠根据随机数字表法分为假手术组、CIRI组、非穴位针刺组、针刺穴位组,每组6只。通过改良线栓法建立CIRI模型大鼠,针刺穴位组针刺“大椎”“人中”“百会”三穴,非穴位针刺组针刺穴位左侧旁开0.3 cm处,假手术组和CIRI组不行针刺。针刺疗法72 h后,通过Zea Longa法评价大鼠神经功能,分离大鼠脑组织,通过TTC法检测脑组织梗死体积,JC-1法检测脑组织线粒体膜电位。通过Western blot检测自噬相关蛋白及PI3K-AKT信号通路相关蛋白表达。结果 与假手术组比较,CIRI组大鼠神经功能损伤评分明显升高[(3.50±0.96)分比(0.00±0.00)分,P<0.05],CIRI组大鼠脑组织线粒体自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、Bcl2腺病素EIB19KD相互作用蛋白(BNIP3)水平[(4.48±0.75)比(1.00±0.14),(4.77±0.44)比(1.00±0.09),P<0.05]显著升高,p62水平[(0.98±0.14)比(5.01±0.17),P<0.05]降低,自噬增强,线粒体膜电位降低[红/绿荧光比(1.08±0.10)比(4.99±0.13),P<0.05],同时PI3K-AKT信号通路相关蛋白磷酸化水平显著降低[p-PI3K:(1.04±0.08)比(5.09±0.07),p-AKT:(0.99±0.15)比(4.43±0.14),p-mTOR:(0.84±0.08)比(5.00±0.16),P<0.05];与非穴位针刺组比较,针刺穴位组CIRI模型大鼠脑组织损伤减轻,表现为大鼠神经功能损伤评分[(2.17±0.90)分比(3.17±0.69)分,P<0.05]、脑梗死体积百分比[(31.25±1.97)%比(39.23±1.89)%,P<0.05]以及脑半球肿胀百分比[(3.42±0.32)%比(4.98±0.37)%,P<0.05]显著降低(P<0.05),线粒体膜电位升高[红/绿荧光比(3.24±0.13)比(1.25±0.06),P<0.05],自噬水平降低,同时PI3K-AKT信号通路相关蛋白p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平显著升高[p-PI3K:(3.07±0.14)比(1.18±0.12),p-AKT:(3.50±0.15)比(1.42±0.13),p-mTOR(2.65±0.16)比(1.01±0.11),P<0.05]。结论 针刺疗法可能通过激活PI3K/AKT信号通路抑制线粒体自噬,从而实现对CIRI模型大鼠的脑保护作用。

中风活心软胶囊通过靶向微小RNA-126诱导缺氧诱导因子-1α/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制研究

目的探讨中风活心软胶囊通过靶向微小RNA(miRNA)-126诱导缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制。方法选取30只无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠,随机分为空白组、模型组与治疗组,每组10只。采用Zea Longa法建立右侧大脑中动脉缺血(MCAO)大鼠模型。治疗组给予中风活心软胶囊。采用改良神经功能损害评分(mNSS)评估大鼠神经功能缺损情况,透射电镜观察缺血半暗区皮质神经元及自噬囊泡超微结构,蛋白质免疫印迹(WB)法和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法分别检测缺血半暗区皮质雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、HIF-1α蛋白及其mRNA和miR-126的表达水平。结果模型组、治疗组mNSS评分均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α蛋白表达水平均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1αmRNA表达水平均高于对照组,miR-126表达水平低于对照组,但治疗组mTOR、HIF-1αmRNA表达水平低于模型组,miR-126表达水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组缺血半暗区皮质神经元及电镜下自噬囊泡数量明显增加,细胞结构损坏减轻。结论中风活心软胶囊可显著提高脑缺血大鼠缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α因子表达,其作用机制可能是通过激活miR-126表达进而靶向调控mTOR/HIF-1α信号通路,促进自噬,从而发挥其脑保护效应。

七氟烷后处理对脑缺血再灌注成年大鼠远期神经功能的影响

目的:探讨七氟烷后处理对脑缺血再灌注成年大鼠远期神经功能的影响。方法:雄性成年SD大鼠随机分为3组:模型组和七氟烷组采用线栓法制备大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,假手术组不插入线栓,栓塞90 min后恢复血流进行再灌注;再灌注即刻开始,假手术组、模型组、七氟烷组大鼠分别吸入1.0最小肺泡浓度(MAC)的七氟烷、氧气、1.0 MAC的七氟烷30 min。再灌注后第1~29天,每组25只大鼠进行神经功能缺陷评分,每48 h一次;再灌注后第29天,每组6只大鼠通过TTC染色法测量脑梗死容积;再灌注24 h后每组3只大鼠测定梗死侧脑含水量。结果:再灌注后第29天,七氟烷组脑梗死容积为(38.9±5.9)%,小于模型组的(46.8±5.5)%(P<0.05)。再灌注后第1天和13天七氟烷组神经功能缺陷评分分别为(1.25±0.44)和(0.63±0.59),低于模型组的(2.00±0.72)和(1.25±0.44)(P<0.05);但第29天时,七氟烷组与模型组评分比较,差异无统计学意义(P>0.05)。七氟烷组梗死侧脑含水量为(80.5±1.0)%,低于模型组(84.0±0.8)%(P<0.05)。结论:七氟烷后处理可改善成年大鼠脑缺血再灌注后早期神经功能。