醒神通督针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬的作用研究

目的从自噬探讨醒神通督针刺抗脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注模型组(简称模型组)和脑缺血再灌注+醒神通督针刺组(简称针刺组)。采用大脑中动脉线栓法构建脑缺血再灌注损伤模型,针刺组大鼠造模前5 d开始干预,取穴“百会”“四神聪”“足三里”,每日针刺1次,直至再灌注24 h。另外2组大鼠只抓取不针刺。再灌注24 h后采用氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色观察脑梗死面积,透射电镜观察神经元及自噬的亚显微结构,Western blot、免疫荧光检测缺血皮层微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein light chain 3B,LC3)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(coiled coil moesin like BCL2 interacting protein,Beclin-1)、自噬相关蛋白(autophagy related protein,Atg)12、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)与磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p-Akt)的表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠大脑中动脉供血区梗死面积明显增加(P<0.05),且缺血皮层神经元结构严重破坏,自噬明显激活,自噬蛋白Beclin-1、Atg12表达及LC3Ⅱ/I比值显著升高(P<0.05),p-Akt表达下降(P<0.05)。与模型组比较,针刺组大鼠脑梗死面积减少(P<0.05),透射电镜显示神经元结构较为正常,自噬体较少。此外,针刺组自噬蛋白Beclin-1、Atg12表达及LC3Ⅱ/I比值明显降低(P<0.05),p-Akt表达显著上调(P<0.05)。结论针刺具有抗脑缺血再灌注损伤作用,可能通过抑制自噬的活化实现。

龙生蛭胶囊保护脑缺血再灌注损伤大鼠的作用及机制研究

目的探讨龙生蛭胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及机制。方法通过改良线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。实验分为假手术组(仅分离血管不插线栓,予同体积生理盐水)、模型组(造模,予同体积生理盐水)、尼莫地平组(阳性对照,造模,给药剂量为20 mg/kg)和龙生蛭胶囊低、中、高剂量组(造模,给药剂量依次为0.72、1.44、2.88 g/kg),每组10只。各组大鼠灌胃相应药液/生理盐水,每天1次,连续7 d。末次给药1 h后,采用Zea Longa评分法对各组大鼠的神经功能缺失情况进行评分;ABC-酶联免疫吸附试验法检测大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平;TTC染色观察大鼠脑梗死体积并计算脑梗死体积比;苏木精-伊红染色观察大鼠脑组织病理形态的变化;免疫组化法检测大鼠脑组织NLRP3蛋白阳性表达情况;实时荧光定量PCR法检测大鼠脑组织Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)mRNA表达;Western blot法检测大鼠脑组织TLR4、NLRP3、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)及细胞核内NF-κB蛋白表达情况。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺失评分,血清TNF-α和IL-6水平,脑梗死体积比,脑组织NF-κB和TLR4 mRNA的相对表达水平,以及脑组织TLR4、NLRP3、p-NF-κB蛋白的相对表达水平及其细胞核内NF-κB蛋白的相对表达水平均显著升高(P<0.01);大鼠脑组织皮层神经细胞间隙增大、水肿明显,可见大量炎性细胞浸润;大鼠脑组织中NLRP3蛋白阳性表达明显增多。与模型组比较,龙生蛭胶囊中、高剂量组及尼莫地平组大鼠以上指标水平均有不同程度逆转,大部分差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);病理形态观察结果明显好转,大鼠脑组织中NLRP3蛋白阳性表达均明显减少。结论龙生蛭胶囊可能通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,抑制神经炎症反应,从而达到对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。

七氟醚预处理和后处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠神经元坏死性凋亡的影响

目的参照改良Zea-longa线栓法建立局灶性脑缺血再灌注损伤的大鼠模型,观察七氟醚处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠神经元的影响,并探讨其作用机制。方法选取成年雄性SD大鼠进行实验,按随机分组原则分为4组:假手术(Sham)组、缺血再灌注(IR)组、七氟醚预处理(Spre)组、七氟醚后处理(Spo)组,每组各10只。造模结束后,采用Longa评分法评测神经行为学;酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)水平;采用Western blotting检测蛋白还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)、Caspase3的表达情况;流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果相对于Sham组,IR组的神经行为学评分、MDA水平、NOX4、Caspase3的表达、神经元凋亡数明显升高,SOD活性降低,差异有统计学意义(P<0.05);与IR组相比,Spre组和Spo组的神经行为学评分、MDA水平、NOX4、Caspase3的表达、神经元凋亡数明显降低,SOD活性升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论在局灶性脑缺血再灌注损伤模型大鼠中,七氟醚预处理和后处理对缺血再灌注大鼠脑组织均有一定的保护作用,其保护作用可能通过抑制氧化应激损伤导致的神经元坏死性凋亡来实现的。

脑络通颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠凋亡及PRMT5、p53的影响

目的:探讨脑络通颗粒对脑缺血再灌注损伤大鼠凋亡、蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)和p53蛋白的影响。方法:将SD成年雄性大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(MCAO/R)、脑络通组(20.2 g/kg)。采用改良线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO/R)模型。脑络通组给予脑络通颗粒(20.2g/kg)灌胃,每天1次,持续7天;假手术组和模型组按同样的方法同时灌胃同体积生理盐水。观察脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积,检测大鼠脑组织细胞凋亡率及PRMT5、p53、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠有明显的神经功能缺损症状,脑梗死体积和脑组织中细胞凋亡率明显增加,Caspase-3、p53、PRMT5蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,脑络通组神经功能缺损症状明显减轻,脑梗死体积和脑组织中细胞凋亡率明显减少,Caspase-3、p53、PRMT5蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:脑络通颗粒可改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损症状,缩小脑梗死体积,可能是通过抑制PRMT5、p53基因表达,下调Caspase-3蛋白和上调Bcl-2蛋白表达水平抑制神经细胞凋亡,从而对脑缺血再灌注损伤大鼠起到神经保护作用。

巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制

背景:巴豆霜能够激活ERK通路、对神经元细胞具有抗凋亡作用,是否具有抑制JNK、p38通路的激活而发挥抗凋亡的协同效应尚不清楚。目的:探讨巴豆霜对脑缺血再灌注损伤大鼠缺血侧皮质区神经元损伤和凋亡的影响及机制。方法:①将90只SD大鼠随机分为假手术组,模型组,巴豆霜低、中、高剂量组,尼莫地平组,每组15只,除假手术组外,剩余各组均采取线栓法制备大脑中动脉栓塞大鼠模型,巴豆霜各组大鼠分别按剂量20,40,60 mg/kg灌胃;假手术组和模型组大鼠给予等量生理盐水,1次/d,连续给药7 d。运用神经功能缺损评分、TTC染色、脑组织含水量、苏木精-伊红染色及尼氏染色筛选出最佳浓度即巴豆霜高剂量。②将120只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、巴豆霜组、JNK抑制剂组、巴豆霜+JNK抑制剂组、p38 MAPK抑制剂组、巴豆霜+p38 MAPK抑制剂组和尼莫地平组,每组15只,除假手术组外,剩余各组大鼠均制备大脑中动脉栓塞大鼠模型,在造模之前30 min,将10μL JNK抑制剂SP600125或10μL p38 MAPK抑制剂SB203580分别注射到大鼠侧脑室,巴豆霜各组大鼠灌胃60 mg/kg巴豆霜,7 d后,采用Western Blot、TUNEL染色及流式细胞术检测各组大鼠脑组织JNK/p38 MAPK信号通路及凋亡相关蛋白水平及细胞凋亡情况。结果与结论:①与假手术组相比,模型组神经功能缺损评分、脑含水量、脑梗死体积、细胞凋亡率显著升高(P<0.05),神经细胞呈散乱分布;与模型组相比,巴豆霜中、高剂量组和尼莫地平组大鼠神经功能缺损评分、脑组织含水量、脑梗死体积显著降低(P<0.05),神经细胞病理形态明显改善;②与JNK抑制剂组相比,巴豆霜+抑制剂组大鼠脑组织p-JNK/JNK、p-p38/p38、Bax表达显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05),而Bcl-2表达显著升高(P<0.05);③结果提示,巴豆霜可能通过抑制JNK/p38 MAPK信号通路的激活、减少神经元凋亡等途径,达到对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用。

壮药双路通脑方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元凋亡的影响

目的 基于氧化应激和炎症反应探讨壮药双路通脑方对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元凋亡的影响。方法 将大鼠随机分为假手术组,模型组,壮药双路通脑方低、中、高剂量组(9.0、18.0、36.0 g/kg),依达拉奉组(3.0 mg/kg),每组18只,采用线栓法构建大脑中动脉闭塞/再灌注模型以模拟脑缺血再灌注损伤,给予相应药物干预6 d,采用Zeal Longa评分法对大鼠进行神经功能缺损评分,TTC染色检测脑梗死面积,HE染色和TUNEL染色检测脑组织缺血半暗带海马CA1区神经元病理损伤和细胞凋亡情况,试剂盒检测脑组织SOD活性和GSH、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α水平,Western blot法检测大鼠脑组织Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3、TLR4、NF-κB p65、Nrf2、HO-1蛋白表达。结果 与模型组比较,壮药双路通脑方中、高剂量组和依达拉奉组大鼠神经功能缺损评分,脑梗死率,神经元凋亡率,脑组织缺血半暗带IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA水平,Bax、TLR4蛋白表达,cleaved-caspase-3/caspase-3、p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低(P<0.05),GSH水平、SOD活性和Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白表达升高(P<0.05)。结论 壮药双路通脑方可抑制氧化应激和炎症反应,抑制神经元凋亡,改善神经功能,减轻脑缺血再灌注损伤大鼠的脑损伤,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路和激活Nrf2/HO-1信号通路有关。

补阳还五汤减轻氧化应激保护脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的作用研究

目的探究补阳还五汤(Buyang Huanwu Decoction,BYHWD)降低氧化应激水平保护脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI)大鼠血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的机制。方法采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型,应用PeriCam PSI激光散斑血流成像系统检测脑血流量判定模型建立是否成功。通过Zea Longa评分评价大鼠神经功能缺损情况;HE染色观察大鼠脑组织病理学改变;干湿重法检测脑水肿程度;伊文思蓝(Evans blue,EB)染色检测BBB通透性;透射电镜观察BBB超微结构改变;试剂盒检测氧化应激相关指标活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)的含量及总超氧化物歧化酶(SOD)活性;免疫组织化学染色及Western blot检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达水平;免疫荧光双染及Western blot检测紧密连接蛋白(tight junction protein,TJP)中Occludin、ZO-1、Claudin-5蛋白的表达水平。结果BYHWD能够降低MCAO/R大鼠神经功能缺损评分,减轻脑组织病理学损伤,减轻血脑屏障结构破坏,延长紧密连接结构致密区,减轻缺血侧大脑脑水肿情况,降低BBB通透性。BYHWD可以降低ROS与MDA水平,提高SOD活性,降低MMP-9表达水平,提高Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白表达水平。结论BYHWD可以升高BBB紧密连接蛋白的表达水平,降低血脑屏障通透性,保护血脑屏障超微结构,减轻脑水肿,其机制可能与BYHWD抗氧化应激,抑制MMP-9的激活相关。

针刺调控自噬蛋白Beclin-1对脑缺血再灌注损伤大鼠海马区Caspase-9的影响

目的 探讨针刺调控细胞自噬对脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)大鼠海马区细胞凋亡的影响及机制。方法 110只SD大鼠随机分为正常组22只、假手术组22只和造模组66只,造模组使用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型,成功后随机均分为模型组、针刺组、药物组,每组各22只。针刺组捆绑并针刺“大椎”“百会”“人中”,药物组注射依达拉奉。Garcia神经功能评分评定大鼠神经功能,TTC染色观察脑梗死情况,透射电镜观察海马区自噬小体,TUNEL检测患侧脑组织细胞凋亡率,免疫组化检测海马区半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白表达,Western blot检测海马区苄氯素-1 (Beclin-1)、Caspase-9表达。结果 干预前后与正常组比较,假手术组各项指标差异均无统计学意义(P>0.05)。干预前,与假手术组比较,造模组神经功能评分下降(P<0.01)。针刺72 h后,与假手术组比较,模型组神经功能评分下降(P<0.01)、脑梗死面积比上升(P<0.01)、缺血侧脑组织细胞凋亡率、海马区Caspase-9、Caspase-3表达量增加(P<0.01)、Beclin-1表达量下降(P<0.05);与模型组比较,药物组、针刺组神经功能评分显著上升(P<0.01)、梗死面积比缩小(P<0.01)、患侧脑组织细胞凋亡率及海马区Caspase-9、Caspase-3下降(P<0.01)、Beclin-1表达量上升(P<0.05)。透射电镜下模型组细胞器肿胀,大多数线粒体变大,见少量溶酶体;针刺组、药物组神经细胞轻度水肿,线粒体轻度肿胀,可见初级溶酶体、自噬小体、自噬溶酶体存在。结论 针刺可调控大鼠自噬关键蛋白抑制CIRI后细胞凋亡,其机制可能与调整自噬影响Caspase-9表达相关。

从铁死亡途径分析针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠脑保护的作用机制

目的观察醒脑开窍针刺法对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能和脑组织病理形态学的影响,检测脑缺血再灌注组织内谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)和膜铁转运蛋白1(ferroportin 1,Fpn1)含量变化,从铁死亡途径探讨针刺对脑缺血再灌注大鼠的脑保护机制。方法25只清洁级雄性Wistar大鼠随机分为假手术组5只、模型组10只、电针组10只。后两组分别再按针刺干预时间分为24 h、72 h两个亚组,每组5只。采用改进的Zea Longa线栓法制作大脑中动脉缺血再灌注模型。电针组予针刺内关、水沟、三阴交,留针期间患侧内关、三阴交穴连接神经穴位刺激仪。采用Zausinger六分法评定神经功能缺损程度,尼氏染色法观察脑组织病理形态改变,酶联免疫吸附测定法对比各组大鼠GSH、MDA、TfR、Fpn1、GPX4的含量。结果与假手术组比较,造模后模型组及电针组神经功能评分均降低(P<0.01)。与模型组比较,电针干预24 h后神经功能评分升高,72 h后评分进一步升高(P<0.01)。造模24 h后,模型组及电针组尼氏小体数量减少,颜色变浅;72 h后模型组尼氏小体更少,电针组尼氏小体数量有一定的恢复。与假手术组比较,模型组MDA、TfR、Fpn1升高、GSH及GPX4降低(P<0.01)。与模型组比较,电针干预24 h及72 h时后MDA、TfR降低、GSH、GPX4及Fpn1升高(P<0.01,P<0.05)。与针刺24 h对比,针刺72 h后MDA、TfR降低更明显,GSH及Fpn1升高更明显(P<0.01,P<0.05)。结论铁死亡是脑缺血再灌注损伤中细胞死亡的重要方式之一,醒脑开窍针刺法可调节脑缺血再灌注大鼠脑组织铁代谢,提高细胞抗氧化能力,抑制神经细胞铁死亡,其脑保护作用与铁死亡途径密切相关。

电针对脑缺血再灌注损伤大鼠Toll样受体4/核因子κB信号通路的影响

背景:炎症反应是诱发脑缺血再灌注损伤的重要因素之一。研究表明电针可有效降低缺血性脑卒中后炎症反应,改善神经功能缺损症状,但机制尚未明确。目的:观察电针对脑缺血再灌注损伤大鼠Toll样受体4/核因子κB信号通路及炎性因子表达的影响。方法:48只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组,每组16只,采用大脑中动脉线栓阻断法制备脑缺血再灌注损伤大鼠模型。造模24 h后对电针组大鼠行电针干预,每天1次,每次20 min,共5 d;假手术组和模型组不做任何干预。干预5 d后根据Longa法评定各组大鼠神经功能损伤程度;TTC染色和苏木精-伊红染色分别观察大鼠脑梗死体积及脑组织病理形态,荧光定量PCR和Western blot分别检测大脑皮质中Toll样受体4、核因子κB mRNA和蛋白表达;酶联免疫法检测血清中炎性因子白细胞介素6、白细胞介素18和肿瘤坏死因子α水平。结果与结论:①与假手术组比较,模型组大鼠神经功能评分、血清白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α水平、大脑皮质Toll样受体4、核因子κB mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,电针组大鼠神经功能评分、大脑皮质Toll样受体4、核因子κB mRNA及蛋白表达,血清白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α水平明显降低(P<0.05,P<0.01);②与假手术组比较,模型组大鼠脑梗死体积明显增加(P<0.01);与模型组比较,电针组大鼠脑梗死体积减小(P<0.05);③模型组神经元排列紊乱,部分神经细胞消失,胞核固缩,结构不完整;电针组大脑皮质神经元变性及神经细胞数量丢失程度均有不同程度减轻;④结果表明,电针能明显改善脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经行为学,减轻脑组织损伤,有效降低血清炎性因子水平,其机制可能与抑制Toll样受体4/核因子κB信号通路有关。

灵仙新苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织氧化应激和炎症反应的调控及神经细胞凋亡的影响

目的研究灵仙新苷对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织氧化应激反应、神经细胞凋亡以及炎症因子的作用。方法45只大鼠分成对照组、模型组(脑缺血再灌注损伤大鼠)、灵仙新苷低剂量组(8 mg/kg)、灵仙新苷中剂量组(16 mg/kg)、灵仙新苷高剂量组(32 mg/kg),每组9只。治疗5 d后,对大鼠进行神经功能评分,TTC染色法检测脑梗死体积,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测脑组织中切割型胱天蛋白酶-3(cleaved-cysteine aspartic acid specific protease-3,C-Caspase-3)、切割型胱天蛋白酶-9(cleaved-cysteine aspartic acid specific protease-9,C-Caspase-9)、核因子κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)蛋白水平,二硝基苯肼法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平,比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)水平,ELISA法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量。结果与对照组比较,模型组大鼠神经功能评分升高(P<0.05),脑梗死体积增加(P<0.05),细胞凋亡指数和C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平升高(P<0.05),LDH、MDA水平升高(P<0.05),SOD、GSH-Px水平降低(P<0.05),IL-1β、TNF-α含量升高(P<0.05),NF-κB p65蛋白表达水平升高(P<0.05)。与模型组比较,灵仙新苷低、中、高剂量组大鼠神经功能评分依次降低(P<0.05),脑梗死体积依次减少(P<0.05),细胞凋亡指数和C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平依次降低(P<0.05),LDH、MDA水平依次降低(P<0.05),SOD、GSH-Px水平依次升高(P<0.05),IL-1β、TNF-α含量依次降低(P<0.05),NF-κB p65蛋白表达水平依次降低(P<0.05)。结论灵仙新苷能降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织氧化应激反应水平,减少细胞凋亡因子C-Caspase-3、C-Caspase-9的表达,抑制炎症介质释放,其机制可能与下调NF-κB信号通路有关。

益生菌对脑缺血再灌注损伤大鼠Aβ表达的影响及神经元的保护作用

目的探讨益生菌干预对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织Aβ表达的影响及神经元的保护作用。方法实验动物为雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为4组,各组n=12:假手术组、模型组、益生菌组、依达拉奉组。假手术组仅分离颈总动脉,其余各组使用线拴法建立脑缺血再灌注模型。脑损伤程度使用神经行为学评分评估;大鼠脑组织梗死面积使用TTC染色观察;大鼠大脑海马CA1区与皮层区神经元病理形态学改变特征使用HE染色观察;Aβ蛋白的表达使用免疫组化实验检测。结果模型组相较假手术组,神经行为学评分升高(P<0.05),脑梗死面积增加(P<0.05),海马CA1区与皮层区神经元出现损伤,Aβ蛋白表达显著上调(P<0.001,P<0.05);益生菌组、依达拉奉组与模型组相比,神经行为学评分降低(P<0.05),脑梗死面积减小(P<0.05),海马CA1区与皮层区神经元损伤减轻,Aβ蛋白表达水平在两组中均显著下调(P<0.001,P<0.05);依达拉奉组改善更为明显。结论益生菌干预可下调Aβ蛋白的表达,减轻脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤、发挥神经元保护作用。

活血荣络方对脑缺血再灌注损伤大鼠SIRT1/PGC-1α信号通路的影响

目的观察活血荣络方对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠SIRT1/PGC-1α信号通路的影响,初步探讨其对CIRI的保护机制。方法60只大鼠随机分为假手术组、模型组、活血荣络方组、EX-527组、EX-527+活血荣络方组和艾地苯醌组,采用线栓法建立CIRI大鼠模型。给药组于造模前36 h首次予相应药物灌胃(10 mL/kg),之后每24 h给药1次,共3次,EX-527组和活血荣络方+EX-527组于再灌注前20 min腹腔注射EX-527(5 mL/kg),其余各组在相同时间灌胃蒸馏水或腹腔注射生理盐水。再灌注24 h后对大鼠进行神经功能缺损评分,HE染色观察缺血皮质区损伤情况,试剂盒检测皮质区三磷酸腺苷(ATP)含量,免疫组化检测缺血皮质区沉默信息调节因子1(SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)蛋白表达,RT-qPCR检测缺血皮质区SIRT1、PGC-1αmRNA表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损评分升高,缺血皮质区神经元损伤严重,ATP含量减少,SIRT1、PGC-1α蛋白和mRNA表达降低(P<0.05)。与模型组比较,活血荣络方组和艾地苯醌组大鼠神经功能缺损评分降低,缺血皮质区神经元损伤改善,ATP含量增加,SIRT1、PGC1-α蛋白和mRNA表达升高(P<0.05);EX-527组大鼠神经功能缺损评分升高,缺血皮质区神经元损伤加重,ATP含量减少,SIRT1、PGC-1α蛋白和mRNA表达降低(P<0.05)。与活血荣络方组比较,活血荣络方+EX-527组大鼠神经功能缺损评分升高,缺血皮质区神经元坏死和凋亡增多,ATP含量减少,SIRT1、PGC-1α蛋白和mRNA表达降低(P<0.05)。结论活血荣络方可促进CIRI大鼠ATP生成,改善神经功能缺损症状,其机制可能与激活SIRT1/PGC-1α信号通路有关。

基于PERK-eIF2α信号通路探讨眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织Atg12表达的影响

目的 通过检测各组脑组织中磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phosphorylation protein kinase-like ER kinase, p-PERK)、磷酸化真核起始因子2α(phosphorylated α subunit of eukaryotic initiation factor 2,p-eIF2α)、自噬相关基因12(antigen, Atg12)蛋白表达水平的变化,探讨眼针是否能够通过调控内质网应激信号通路PERK-eIF2α影响脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)大鼠脑组织Atg12的表达。方法 建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,实验分为4组,即:对照组、假手术组、模型组、眼针组。末次针刺后,对各组大鼠进行神经功能缺损评分,透射电镜观察各组大鼠自噬小体的表达情况,然后采用Western blot法检测脑组织中p-PERK、p-eIF2α、Atg12蛋白表达。结果 与对照组和假手术组相比,模型组大鼠神经功能缺损评分、脑组织中p-PERK、p-eIF2α、Atg12蛋白表达均升高,差异具有统计学意义(P<0.01),自噬小体数量增多;与模型组相比,眼针组大鼠神经功能缺损评分、脑缺血组织中p-PERK、p-eIF2α、Atg12的蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),自噬小体数量减少。结论 眼针能够降低脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑组织自噬蛋白Atg12的表达,其机制可能与调控内质网应激通路PERK-eIF2α有关。

“通督调神”电针预处理介导miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信号通路对脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮质线粒体通透性转换孔的影响及机制探讨

背景缺血性脑卒中发病率、死亡率、致残率均较高,溶栓后的再灌注损伤对患者影响较大,针刺是治疗本病的特色疗法,但作用机制尚不明确。目的探讨“通督调神”电针预处理对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠miR-124-3p/糖原合成酶激酶β(GSK-3β)/亲环素D(Cyp-D)信号通路及线粒体膜通透性转换孔(MPTP)的影响,探讨其防治CIRI的可能机制。方法2022年6—8月,将100只清洁级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组、抑制剂组和电针+激动剂组,每组20只。造模前干预7 d,电针组、电针+激动剂组选取通督调神穴组:百会、风府、大椎穴进行电针干预,1次/d,连续7 d;造模前24 h电针+激动剂组和抑制剂组分别侧脑室注射miR-124激动剂和抑制剂(5 nmol)。除假手术组,余组采用改良线栓法制备大鼠右侧脑缺血再灌注模型;造模成功后,取大鼠右侧脑皮质,采用改良神经功能损伤评分量表(mNSS)、TTC染色观察各组大鼠神经功能损伤程度,TUNEL染色以及透射电镜观察神经细胞损伤情况;免疫荧光染色、Western blotting、实时荧光定量PCR检测各组大鼠脑皮质GSK-3β、p-GSK-3β、Cyp-D、细胞色素C(Cyt-C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达;流式细胞检测MPTP开放程度,MPTP阳性细胞率越高,代表MPTP开放程度越大。结果除假手术组,各组大鼠均造模成功。与假手术组比较,模型组大鼠mNSS评分及相对脑梗死体积均增加,线粒体结构破坏严重,细胞凋亡指数升高,p-GSK-3β、Cyp-D阳性表达分别减弱和增强,miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表达增高,p-GSK-3β/GSK-3β值降低,Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3蛋白相对表达量增高,MPTP开放程度增加(P<0.05)。与模型组比较,电针组、抑制剂组mNSS评分及相对脑梗死体积均降低,线粒体结构破坏减轻,p-GSK-3β/GSK-3β增加,Caspase-3蛋白相对表达量降低;电针+激动剂组GSK-3βmRNA表达增高(P<0.05);电针组、抑制剂组、电针+激动剂组细胞凋亡指数降低,p-GSK-3β、Cyp-D阳性表达分别减弱和增强,miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表达降低,Cyp-D、Cyt-C蛋白相对表达量降低,MPTP开放程度降低(P<0.05)。与电针组比较,抑制剂组p-GSK-3β阳性表达增强,Cyp-D阳性表达减弱,miR-124-3p及Cyp-D、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表达降低,GSK-3βmRNA表达增高,Cyp-D、Cyt-C蛋白相对表达量降低,MPTP开放程度降低(P<0.05);电针+激动剂组细胞凋亡指数增高,p-GSK-3β阳性表达减弱,Cyp-D阳性表达增强,miR-124-3p、Cyt-C、Caspase-3 mRNA表达增高,Cyp-D、Cyt-C蛋白相对表达量增高,MPTP开放程度增加(P<0.05)。结论“通督调神”电针预处理可减轻CIRI大鼠神经损伤,其机制可能与介导miR-124-3p/GSK-3β/Cyp-D信号通路、抑制MPTP开放进而减轻细胞损伤相关。这一研究结果从机制上进一步验证了“通督调神”针法治疗CIRI的疗效,同时为中医“治未病”提供新的科学依据,促进临床应用。

扶阳祛邪方对脑缺血再灌注损伤大鼠脑神经保护及作用机制探讨

目的探究扶阳祛邪方对脑缺血再灌注损伤大鼠脑神经保护及作用机制。方法选取45只成年健康雄性清洁级(SPF)大鼠,通过随机数字表法分为假手术组、模型组和扶阳祛邪方组(各15只)。造模成功后,假手术组和模型组等体积生理盐水灌胃、扶阳祛邪方组等体积扶阳祛邪方溶液灌胃。观察和比较3组大鼠神经功能缺失评分、细胞凋亡和B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、BCL2-Associated X的蛋白质(BCL2-Associated X,Bax)、半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)阳性细胞数、Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)蛋白相对表达及脑梗死体积。结果3组大鼠均造模成功,成功率100.00%。造模成功24 h后模型组、扶阳祛邪方组大鼠神经功能评分均高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗7 d较造模成功24 h后,模型组和扶阳祛邪方组神经功能评分均下降且治疗7 d扶阳祛邪方组评分低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。TUNEL染色计数阳性细胞数、凋亡指数和Bax、Caspase-3染色计数阳性细胞数分别比较,以模型组最高,其次为扶阳祛邪方组、假手术组,差异有统计学意义(P<0.05);Bcl-2染色计数阳性细胞数扶阳祛邪方组高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组TLR4蛋白灰度值(0.53±0.10)、模型组(0.81±0.17)、扶阳祛邪方组(0.62±0.12),以模型组TLR4蛋白灰度值最高、其次为扶阳祛邪方组和假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。脑梗死面积及体积百分比以模型组最高、其次为扶阳祛邪方组,假手术组未出现脑梗死,差异有统计学意义(P<0.05)。结论扶阳祛邪方通过上调脑缺血再灌注大鼠脑皮质Bcl-2细胞数及下调Bax、Caspase-3细胞数和TLR4蛋白表达而具有调控神经细胞凋亡的作用机制,对保护缺血区域脑神经、减少脑梗死体积等发挥着积极效应。

针刺调控脑缺血再灌注损伤大鼠海马区环状RNA_009775表达的研究

目的研究针刺对脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)大鼠海马区环状RNA_009775表达的影响,探索针刺对CIRI可能的作用机制。方法将39只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组,每组13只。除假手术组外,其余两组均采用线栓法制备CIRI模型。造模后,针刺组大鼠捆绑固定行针刺干预,间隔12 h进行1次,共7次;假手术组与模型组大鼠仅捆绑不针刺。Garcia评分法、TTC染色法评估针刺疗效;基因芯片技术筛选针刺组/模型组、模型组/假手术组核心共同差异表达circRNA;qRT-PCR法对芯片筛选结果进行验证;TargetScan软件预测核心circRNA的下游mi RNA及mRNA,构建核心circRNA的调控网络,并对m RNA进行基因本体功能富集分析;Western blot法验证神经元核抗原抗体(neuron specific nuclear protein,NEUN)表达量。结果干预后,与假手术组相比,模型组大鼠Garcia评分、NEUN和circRNA_009775表达量显著降低(P<0.01),脑梗死面积比显著升高(P<0.01);与模型组相比,针刺组脑梗死面积比显著降低(P<0.01),Garcia评分、NEUN和circRNA_009775表达量显著升高(P<0.05或P<0.01)。芯片筛选核心共同差异表达circRNA,经qRT-PCR验证circRNA_009775表达趋势与芯片结果一致,结合靶关系预测,构建了含有1个circRNA、12个miRNA、31个mRNA的调控网络。基因本体功能富集分析显示mRNA主要涉及神经系统发育、神经元生成等生物过程。结论针刺具有改善CIRI大鼠神经功能缺损、降低脑梗死面积、部分减轻海马区神经元损伤的作用,其机制可能与调控circRNA_009775介导的潜在调控网络、促进神经系统发育、神经元生成等生物过程有关。

具栖冬青苷对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能影响及其机制研究

目的观察具栖冬青苷对脑缺血再灌注损伤大鼠神经元的保护作用及其机制。方法60只健康雄性Wistar大鼠随机分为6组:假手术组,模型组,Caspase-3抑制剂组(4 mg/kg),具栖冬青苷高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低剂量组(50 mg/kg),每组10只。各组于造模前连续灌胃相应药物7 d,假手术组和模型组给予生理盐水。MCAO法制造大鼠脑缺血模型,2 h后拔栓,再灌注24 h。对各组大鼠神经功能进行评分;水迷宫法和跳台法检测大鼠学习记忆能力;流式细胞仪检测神经元凋亡情况;荧光定量PCR和Western blotting法检测凋亡相关Caspase-3、Bcl-2、Bax m RNA和蛋白的表达。结果与模型组相比,具栖冬青苷高、中、低剂量组大鼠的神经功能评分显著降低(P<0.05);水迷宫潜伏期缩短,穿越安全平台次数增多(P<0.05);跳台潜伏期延长,错误次数降低(P<0.05);神经元凋亡率显著降低(P<0.05);Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05),Bcl-2的表达显著升高(P<0.05)。结论具栖冬青苷能显著改善脑缺血再灌注大鼠的神经行为学结果,其机制可能是通过抑制凋亡通路BAX/Caspase-3而发挥抗神经元凋亡作用。

lncRNA NEAT1沉默通过IL-10/STAT3信号通路调节小胶质细胞极化对脑缺血再灌注损伤大鼠的影响

目的探讨长链非编码RNA核富集转录体1(lncRNA NEAT1)沉默通过白细胞介素(IL)-10/信号传导与转录激活因子3(STAT3)信号通路调节小胶质细胞极化对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠的影响。方法SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、CIRI组、CIRI+si-NC组、CIRI+si-NEAT1组,每组24只。除Sham组外,其余各组大鼠采用线栓法构建CIRI模型。建模结束后,各组大鼠给予对应处理7 d。对大鼠神经功能缺损进行评分;观察脑组织病理学变化;检测脑梗死体积百分比,脑组织中离子钙接头蛋白分子1阳性(Iba1+)细胞中M1型、M2型极化标志物阳性(Iba1+CD86+、Iba1+CD206+)细胞的数量,IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-4、IL-10,lncRNA NEAT1、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg-1)、IL-10 mRNA,IL-10、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白水平。结果与Sham组相比,CIRI组大鼠脑组织病理损伤严重,神经功能缺损评分、脑梗死体积百分比、脑组织中Iba1+CD86+、Iba1+CD206+阳性细胞数量、CD86/CD206比值、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平、lncRNA NEAT1、iNOS、Arg-1、IL-10 mRNA水平、IL-10、p-STAT3/STAT3蛋白水平显著升高(P<0.05);与CIRI组和CIRI+si-NC组相比,CIRI+si-NEAT1组大鼠脑组织病理损伤减轻,神经功能缺损评分、脑梗死体积百分比、脑组织中Iba1+CD86+阳性细胞数量、CD86/CD206比值、IL-1β、TNF-α水平、lncRNA NEAT1、iNOS mRNA水平显著降低(P<0.05),Iba1+CD206+阳性细胞数量、IL-4、IL-10水平、Arg-1、IL-10 mRNA、IL-10、p-STAT3/STAT3蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论沉默lncRNA NEAT1可能通过激活IL-10/STAT3信号通路,调控小胶质细胞极化,从而改善CIRI大鼠脑组织损伤。

GLP-1/GIP双靶点受体激动剂DA5-CH对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的作用及其机制研究

目的研究胰高血糖素样肽-1/抑胃肽(GLP-1/GIP)双靶点受体激动剂DA5-CH对脑缺血再灌注损伤(I/R)大鼠脑组织的作用及其可能机制。方法将30只脑I/R大鼠随机分为模型组、DA5-CH组、DA5-CH+SB431542组,每组10只。另取10只大鼠仅做假手术(假手术组)。DA5-CH组腹腔注射10 nmol/kg DA5-CH;DA5-CH+SB431542组腹腔注射10 nmol/kg DA5-CH和5 mg/kg SB431542,假手术组、模型组腹腔注射等体积生理盐水。检测各组大鼠脑组织含水量;免疫组织化学染色检测海马CA1区神经核抗原(NeuN)阳性细胞数;Western blotting检测脑组织转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、p-Smad3蛋白的表达。结果与假手术组比较,模型组脑组织含水量增加,海马CA1区每个视野NeuN阳性细胞数减少,脑组织TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,DA5-CH组脑组织含水量降低,海马CA1区NeuN阳性细胞数增加,脑组织TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表达降低(P<0.05);与DA5-CH组比较,DA5-CH+SB431542组脑组织含水量增加,海马CA1区NeuN阳性细胞数减少,脑组织TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表达升高(P<0.05)。结论GLP-1/GIP双靶点受体激动剂DA5-CH可保护脑I/R大鼠神经功能,减少脑组织含水量及神经元坏死,减轻海马区病理改变,其作用机制可能与激活TGF-β1/Smads通路有关。