脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的免疫效果

目的研究原核重组表达的B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白0315(rNMB0315)在诱导小鼠产生特异性免疫应答中的作用、免疫血清抗体体外杀菌活性和重组蛋白的免疫保护效果,初步评价rNMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的潜力。方法将构建的原核表达载体p ET30a-NMB0315转化大肠杆菌BL21表达重组蛋白,纯化鉴定后的重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,检测体液免疫和细胞免疫水平;测定血清抗体在补体介导下的体外杀菌活性,观察rNMB0315蛋白疫苗对实验小鼠的免疫保护效果。结果 rNMB0315具有良好的免疫原性,能诱导产生较高水平的体液免疫应答:包括血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG3、IgG2b和生殖道黏膜特异性分泌型IgA(s IgA),免疫后第6周抗体效价分别为1∶150 000、1∶85 000、1∶60 000、1∶35 000、1∶30 000和1∶30 000;也能激发较高水平的细胞免疫应答,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的刺激指数(SI)值明显高于PBS、Freund佐剂对照组。在免疫的2、4、6周,血清IgG2a/IgG1比值均小于1,提示rNMB0315疫苗以诱导Th2细胞性体液免疫应答为主。rNMB0315疫苗免疫血清在补体介导下的体外杀菌抗体效价为1∶128;72 h内,对实验小鼠的免疫保护率为90%。结论原核表达的rNMB0315具有良好的免疫活性和免疫保护效果,NMB0315外膜蛋白具有作为预防B群流脑蛋白疫苗候选抗原的潜力。

PCR结合酶切-序列比对法鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株

目的用PCR结合酶切-序列比对法对B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行鉴定。方法用玻片凝集法对不同来源的15株B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行初步检定,再用PCR结合酶切-序列比对法对上述15株菌株进行进一步鉴定,即用PCR结合酶切法扩增菌株的唾液酸转移酶sia D基因并对PCR产物进行酶切后,用BLAST软件将PCR产物测序结果与Gene Bank中原始sia D序列比对。结果 15株菌株玻片凝集结果均为阳性;15株菌株的PCR产物片段大小均为460 bp;TaqⅠ酶切后,13株菌株的酶切产物片段大小仍为460 bp,其PCR产物测序比对结果与B群脑膜炎奈瑟菌原始sia D序列同源性均达到99%;其余2株酶切产物片段大小约200 bp,与C群脑膜炎奈瑟菌sia D原始基因序列同源性分别为98%和99%。结论 15株菌株经PCR结合酶切-序列比对法鉴定,13株为B群脑膜炎奈瑟菌菌株,2株为C群脑膜炎奈瑟菌菌株;该方法可准确鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株。

脑膜炎奈瑟氏菌B群引起一例新生儿流脑的实验室诊断及流行病学调查

目的:明确诊断并分析1例新生儿B群流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)病例的流行病学特点进行调查分析,为进一步完善流脑诊断、防控策略与措施提供科学依据。方法:对新生儿疑似流脑病例进行流行病学调查并收集有关临床资料。收集病例的血液标本及其密切接触者的咽试子标本并进行菌株的分离培养和分型。结果:病例的血标本及其密切接触者患儿外祖母咽试子标本均分离到B群流脑菌株,2株菌株对9种抗生素的药敏结果完全一致。结论:结合该病例的流行病学资料、临床症状、实验室检测结果,判断该病例为B群脑膜炎奈瑟菌引起的病例。预防控制B群流脑的关键是主要采取以加强病原学监测、敏感药物使用的综合措施。

B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护作用初步研究

目的:构建B群脑膜炎奈瑟菌pc DNA3.1(+)/NMB0315真核表达重组质粒,检测其诱导小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平、免疫血清体外杀菌效果及免疫保护作用,初步探讨NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护效果,为研制一种新的预防B群流脑的核酸疫苗提供实验依据。方法:以B群脑膜炎奈瑟菌标准株MC58基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增NMB0315基因,克隆至pc DNA3.1(+)真核表达载体中,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。构建成功的pc DNA3.1(+)/NMB0315重组质粒转染COS-7细胞和RAW264.7细胞,免疫细胞化学染色法和Western blot法检测重组蛋白在真核细胞中的表达。大量提取重组质粒,肌注免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内抗NMB0315的特异性体液免疫和细胞免疫水平;测定免疫血清体外杀菌滴度,观察核酸疫苗对实验小鼠的免疫保护效果。结果:构建的核酸疫苗pc DNA3.1(+)/NMB0315能够在真核细胞中有效转录和表达;免疫小鼠后能诱导产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。在疫苗免疫后的2、4、6周,pc DNA3.1(+)/NMB0315组和pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G组血清总Ig G及Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig G3亚类抗体水平呈递增趋势,均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P<0.001);小鼠血清Ig G2a/Ig G1比值均小于1;生殖道灌洗液中特异性s Ig A水平均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P<0.01)。免疫第6周,脾淋巴细胞刺激指数(SI)均明显高于对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.05)。pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G、pc DNA3.1(+)/NMB0315疫苗组免疫血清补体介导的体外杀菌效价分别为1∶128和1∶64;在致死量B群脑膜炎奈瑟菌MC58攻击后72 h存活率分别为70%和65%,对照组[PBS,pc DNA3.1(+),Cp G]72 h存活率为0。结论:NMB0315核酸疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫(包括黏膜免疫)和细胞免疫应答;免疫血清补体介导的体外杀菌活性较高;NMB0315核酸疫苗对感染B群脑膜炎奈瑟菌小鼠具有较强的免疫保护作用。

Chi-CpG NP的制备及其对rNMB0315蛋白的免疫效果

目的制备黏膜免疫佐剂Chi-CpG NP,并检测其对重组B群脑膜炎奈瑟菌0315蛋白(rNMB0315)的免疫效果。方法用壳聚糖纳米颗粒(Chi NP)包裹免疫刺激分子(CpG-ODN)合成Chi-CpG NP,随后检测其理化性质和安全性。将不同黏膜免疫佐剂与rNMB0315充分混合、吸附,滴鼻免疫雌性BALB/c小鼠,检测PBS组、rNMB0315组、rNMB0315+CpG组、rNMB0315+Chi NP组、rNMB0315+Chi-CpG NP组小鼠免疫42天后的体液免疫(IgG、IgG1、IgG2a、sIgA)、细胞免疫水平[白细胞介素(IL)-4、γ干扰素(IFN-γ)、IL-17A]、免疫保护效果以及血清体外杀菌活性。结果成功制备的Chi-CpG NP呈球形,大小均一,有较好的吸附性能和良好的安全性。小鼠免疫42天后,体液免疫和细胞免疫水平rNMB0315+Chi-NP组、rNMB0315+Chi-CpG NP组高于rNMB0315组(P<0.05);rNMB0315+Chi-CpG NP组高于rNMB0315+CpG组和rNMB0315+Chi-NP组(P<0.05)。致死剂量B群脑膜炎奈瑟菌攻击各组小鼠后,rNMB0315+Chi-CpG NP组小鼠存活率最高;血清体外杀菌抗体滴度为1∶4。结论成功制备了Chi-CpG NP。Chi-CpG NP能增强rNMB0315蛋白的免疫效果,提高小鼠的存活率。

北京发现ST4821克隆群B群脑膜炎奈瑟菌

目的对2013年1月北京市1例流行性脑脊髓膜炎(流脑)死亡病例标本进行脑膜炎奈瑟菌检测,了解感染病原及分离菌株的分子流行病学特征。方法对患者脑脊液标本进行细菌分离培养,通过常规细菌学试验对分离菌株进行脑膜炎奈瑟菌鉴定、实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative PCR)方法检测患者脑脊液和抗凝血中脑膜炎奈瑟菌核酸,同时对鉴定的菌株进行多位点序列分型(MLST)分析、外膜蛋白PorA分型和FetA分型,以及体外药物敏感试验。结果从患者脑脊液和抗凝血标本中均检测到脑膜炎奈瑟菌种特异基因ctrA和血清群B特异基因siaD。从患者脑脊液中分离到1株可疑阳性菌,经实验确诊为B群脑膜炎奈瑟菌。PorA为P1.20,23-9,FetA为F1-91;多位点序列分型分析显示基因型为ST10051,属于ST4821序列群。该菌株对复方新诺明为中等耐药,对环丙沙星和四环素耐药,对青霉素、头孢噻肟、头孢曲松、左氧氟沙星、美罗培南、氯霉素、利福平等药物均敏感。从密切接触者咽拭子中未分离到脑膜炎奈瑟菌。结论该菌株经鉴定为B:P1.20,23-9:F1-91:ST10051(ST4821序列群)。北京地区人群中已经存在高致病性ST4821克隆群B群脑膜炎奈瑟菌,并引发死亡病例,提示应全面掌握本地区脑膜炎奈瑟菌健康人群携带情况及病例菌株分子流行病学资料,为流脑的预防控制提供实验室数据支撑。

湖南省B群脑膜炎奈瑟菌药物敏感性及分型

近年来,湖南省流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）流行以C群脑膜炎奈瑟菌（Nm）为主〔1〕,2009年2月,首次从流脑患者身上分离出B群脑膜炎奈瑟菌,2010年在健康人群流脑咽拭子中,同时分离到4株B群脑膜炎奈瑟菌。为掌握湖南省B群脑膜炎奈瑟菌的分子生物学特征,为有效的预防和控制其流行提供依据,

湖南省B群脑膜炎奈瑟菌的药物敏感性及PFGE分型特征分析

目的了解湖南省B群脑膜炎奈瑟菌的病原生物学特征、药物敏感性以及PFGE分型特征。方法 29株B群流脑菌株经生化和血清学鉴定后,对菌株进行药敏试验和脉冲场凝胶电泳分型。结果 29株B群脑膜炎奈瑟菌菌株对米诺环素、头孢曲松、头孢噻肟、美罗培南、利福平、氯霉素和阿奇霉素全部敏感,对青霉素和氨苄青霉素的敏感率为75.86%和86.21%,对环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明耐药率较高,耐药率为34.48%、41.38%和96.55%;29株B群脑膜炎奈瑟菌的PFGE分型共分为22个带型,不同地区间分离株可见带型一致的情况。结论 B群脑膜炎奈瑟菌对抗菌药物的敏感性与其它血清群基本一致,PFGE分子分型呈现高度多态性,健康人群携带者的带型与病人的带型呈现一定的遗传相关性,应持续开展监测,密切关注菌株的传播趋势。

2株B群脑膜炎奈瑟菌的分子生物学分析

[目的]探讨分离自大连市开发区2005年和2008年外来人口中2例暴发型脑膜炎死亡病例2株B群脑膜炎奈瑟菌的分子生物学特征及其关联性。[方法]2010年,对2株B群流脑菌株进行脉冲场电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)分型分析。[结果]2株菌PFGE型相似性为100%,应为同一来源;MLST分析结果均为ST5662型。菌株对青霉素、头孢类、阿齐霉素、氯霉素、利福平等多种抗菌药物敏感。[结论]2株B群脑膜炎奈瑟菌分子分型结果一致,为同一科隆。

1例由B群脑膜炎奈瑟菌引起的新生儿脑膜炎的调查

目的为明确诊断1例新生儿B群脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑脊髓膜炎。方法对1例新生儿疑似流脑病例进行流行病学调查。收集病例的临床标本及其密切接触者相关的咽拭标本进行脑膜炎奈瑟菌的分离培养。结果患儿的脑脊液和其父亲咽试子标本中均分离到B群脑膜炎奈瑟菌菌株,且2株菌株对9种抗生素的药敏结果完全一致。结论结合该病例的临床流行病学资料及相关的实验室检测结果,该患儿是B群脑膜炎奈瑟菌引起的病例。

不同信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白表达的影响

目的探讨不同信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白(factor H-binding protein,f HBP)表达的影响。方法运用PCR方法将B群脑膜炎奈瑟菌f HBP原始信号肽分别替换为大肠埃希菌主要外膜脂蛋白(major outer membrane lipoprotein,MLP)、脂蛋白-28(lipoprotein-28,LP)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)P4外膜蛋白信号肽,并将其分别连接至p ET-30a表达载体,转化入大肠埃希菌感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达水平。结果替换了P4、LP和MLP信号肽的重组B群脑膜炎奈瑟菌f HBP表达量较带原始信号肽的B群脑膜炎奈瑟菌f HBP相比,分别提高了2.68、1.94和2.91倍。结论替换MLP信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌f HBP蛋白表达的影响最大,为提高B群脑膜炎奈瑟菌f HBP表达量的研究工作提供了新思路。

以重组B群脑膜炎奈瑟菌fHBP为载体的结合疫苗制备及免疫原性研究

目的:以重组B群脑膜炎奈瑟菌(Nesseria meningitidis,Nm)外膜蛋白fHBP(recombinant factorH binding protein,rfHBP)为载体与C群多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)共价结合制备结合疫苗并免疫小鼠,检测小鼠血清中针对B群和C群Nm的杀菌抗体,评价该重组蛋白作为结合疫苗载体的可行性及该结合疫苗对B群Nm的交叉保护性。方法:扩增fhbp并连接到pET30a(+)表达载体上,转化至大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍亲和层析柱纯化rfHBP,CNBr活化法将rfH-BP与GCMP共价结合,制备结合疫苗,免疫小鼠,间接ELISA法检测血清中GCMP抗体和rfHBP抗体滴度,TTC法检测结合物诱导的分别针对B群和C群Nm的杀菌抗体水平。结果:成功扩增fhbp并连接至pET30a(+)表达载体上,大肠杆菌中诱导表达rfHBP,纯化后与GCMP结合。结合物免疫小鼠后,检测到的针对GCMP的IgG抗体滴度与GCMP组比较有明显加强效应;三针免疫后,针对C群Nm的杀菌抗体滴度高于GCMP对照组,有统计学意义(P<0.05);针对B群Nm的杀菌抗体滴度与rfHBP对照组间无统计学意义(P>0.05);两组结合物诱导的分别针对B群Nm CMCC29361株和ATCC700111株的杀菌抗体滴度间无统计学意义(P>0.05)。结论:结合疫苗免疫小鼠后检测到的针对C群Nm的杀菌抗体高于单独GCMP组,证明该重组蛋白可作为结合疫苗的载体蛋白;且在结合过程中较好地保留了蛋白的免疫原性,对B群Nm有良好的交叉保护作用。

响应面法优化产H因子结合蛋白的重组大肠埃希菌发酵条件

目的 使用响应面法(response surface methodology, RSM)对重组大肠埃希菌fHBP-B-1/BL21(DE3)的发酵条件进行优化,以提高目的蛋白表达量。方法 在单因素试验的基础上,利用Plackett-Burman试验筛选出对目的蛋白表达有显著影响的因素;再用最陡爬坡试验及Box-Behnken设计进一步优化试验条件并进行验证。结果 单因素试验结果显示,在酵母抽提物质量浓度为12.500 g/L、硫酸镁质量浓度为0.250 g/L、初始pH为6.00、诱导培养时间为8 h、诱导温度为35.00℃时,目的蛋白表达量最高,为363.04μg/mL。酵母抽提物质量浓度、硫酸镁质量浓度及诱导培养温度是影响目的蛋白表达量的显著因素。发酵条件优化后,酵母抽提物质量浓度为10.500 g/L、硫酸镁质量浓度为0.220 g/L、初始pH为6.00、诱导培养时间为4 h、诱导培养温度为37.50℃时,可以获得425.62μg/mL的目的蛋白,较单因素试验结果提高了17.25%。结论 重组大肠埃希菌fHBP-B-1/BL21(DE3)的发酵条件优化后,目的蛋白的表达量明显提升,为重组B群脑膜炎球菌疫苗后续工艺的开发奠定基础。

1例罕见的新生儿B群流脑死亡病例的实验室结果分析

目的明确诊断并分析1例新生儿疑似流行性脑膜炎死亡病例可能的传染来源和传播途径。方法收集死亡病例的血液标本及其密切接触者的咽试子标本并进行菌株的分离培养和分型及药敏试验。结果死亡病例的血标本及其密切接触者患儿父亲咽试子标本均分离到B群脑膜炎奈瑟菌菌株,2株菌株对氨苄西林、环丙沙星、利福平、氯霉素、头孢噻吩、红霉素及四环素均敏感,对磺胺类药耐药。结论根据该病例的特点和实验室检测结果,判断该病例为B群脑膜炎奈瑟菌引起的死亡病例。

海南省首例B群流行性脑脊髓膜炎病例病原学分析

目的对海南省海口市2015年2月发现的1例新生儿B群流行性脑脊髓膜炎(流脑)病例进行病原学分析。方法采集新生儿血液接种于血培养瓶,对培养出的菌株采用生化鉴定、血清学分型和普通聚合酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)技术鉴定、基因分型;分离株进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)及14种抗生素敏感性试验。结果从新生儿血液中培养出的菌株经生化鉴定、血清学分型与PCR技术鉴定、基因分型结果一致,均是B群脑膜炎奈瑟菌。该菌株MLST结果为序列型ST-7962,属无序列群分类。该菌株对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、美罗培南、氯霉素、阿奇霉素、米诺环素、利福平敏感,对左氧氟沙星中介,对复方新诺明、磺胺、环丙沙星、萘啶酸耐药。结论海南省发现新生儿感染B群脑膜炎奈瑟菌病例,应加强病原菌监测与研究,以便采取针对性的防控措施,合理使用抗生素。

深圳市一起B群流行性脑脊髓膜炎疫情的调查

目的调查B群流行性脑脊髓膜炎(流脑)疫情的原因。方法于2018年2月22、27日对患者和密切接触者进行流行病学调查,并收集脑脊液、血液和咽拭子样品进行分离培养、PCR检测和二代测序。结果在患者血液及其母亲咽拭子中均分离出B群脑膜炎奈瑟菌,多位点序列分型均为ST-3200/CC4821,2株菌的16S rRNA及耐药基因、多肽编码基因的相似性为100%。结论该疫情是由健康携带B群脑膜炎奈瑟菌的母亲传播给患者而引起。

响应面法优化fHBP-A蛋白双水相萃取工艺的探究

目的采用双水相萃取技术对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白A(fHBP-A)进行分离纯化,研究不同双水相萃取体系对fHBP-A粗提纯化的影响,应用响应面法优化fHBP-A在PEG/(NH_(4))_(2)SO_(4)双水相体系中的萃取工艺。方法首先建立PEG 2000/(NH_(4))_(2)SO_(4)、PEG 4000/(NH_(4))_(2)SO_(4)、PEG 6000/(NH_(4))_(2)SO_(4)和乙醇/(NH_(4))_(2)SO_(4)共4种双水相萃取体系相图;然后考察PEG相对分子质量、PEG质量分数、(NH_(4))_(2)SO_(4)质量分数、萃取体系pH这4个因素对fHBP-A萃取率、下相中fHBP-A纯度的影响;最后采用Box-Behnken试验设计以及响应面分析对fHBP-A双水相萃取工艺进行优化。结果确定fHBP-A双水相萃取的最佳工艺条件为PEG 4000质量分数为28%、萃取体系pH为6.0、(NH_(4))_(2)SO_(4)质量分数为13%。此条件下fHBP-A纯度达到68.11%。结论采用优化的工艺可以较好地提取及初步纯化fHBP-A,为进一步fHBP-A的纯化研究奠定基础。

2019年浙江省台州市1例新生儿流行性脑脊髓膜炎病例病原学分析

目的对2019年1月浙江省台州市1例流行性脑脊髓膜炎(流脑)病例及密切接触者进行病原学特征分析,为流行病学调查提供分子溯源依据。方法对患者血液标本、脑脊液标本和10名密切接触者的咽拭子进行脑膜炎奈瑟菌分离,对分离菌进行生化、血清分群鉴定以及体外药敏试验,同时采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)进行分子分型分析。结果从患者血液标本和2名密切接触者咽拭子标本中分离到3株脑膜炎奈瑟菌,患者和1名密切接触者的菌株血清群均为B群,另1名密切接触者的菌株为不可分群。药敏结果显示,3株菌株对头孢呋辛钠、头孢曲松、美洛培南等敏感,对米诺环素不敏感,对环丙沙星和复方新诺明耐药,对青霉素G和氯霉素中介。PFGE分型显示,3株菌的相似度为100%,MLST均为ST-5664型,属于高致病性ST-4821克隆群。结论台州市人群中存在高致病性ST-4821克隆群B群脑膜炎奈瑟菌,并引起了感染病例,提示应当加强对本地区健康人群携带情况及菌株分子特征的监测,为流脑感染病原菌的溯源调查与控制提供实验室支持。