C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物制备方法的比较

目的对C群脑膜炎球菌多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)蛋白结合物的5种制备方法进行比较。方法以GCMP作为多糖抗原,破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)和重组绿脓杆菌外毒素A(recombinant exoprotein A from Pseudomonas aeruginosa,r EPA)作为载体蛋白,采用5种结合路线制备7种结合物,并对其生化指标、免疫原性及磷酸铝佐剂的免疫增强效果进行检测。结果不同的结合方法均可将不同载体蛋白与多糖有效结合,在小鼠体内均具有良好的免疫原性。7种结合物的分子大小分布、游离多糖含量、多糖/蛋白值、回收率及免疫原性等指标有较大差异;采用相同结合方法,以TT和r EPA作为载体蛋白制备的结合物的生化指标及免疫原性无差异;磷酸铝佐剂可显著提高结合物的免疫原性。结论在选择GCMP蛋白结合物制备方法时应综合考虑原料多糖的化学结构、载体蛋白类型、结合路线、结合物纯化方法、质量控制方法和剂型等因素。本实验为GCMP蛋白结合物制备路线的选择提供了实验依据。

A群脑膜炎球菌多糖-重组蛋白Pep10结合物的制备及其免疫原性

目的制备A群脑膜炎球菌多糖(GAMP)-重组蛋白Pep10结合物,并检测其免疫原性,探讨重组蛋白Pep10作为一种候选载体蛋白的可行性。方法GAMP经溴化氰(CNBr)活化后,共价接合己二酰肼(ADH)手臂,在碳二亚胺(EDAC)催化下与重组蛋白Pep10偶联,制备结合物GAMP-ADH-Pep10。纯化后免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗GAMP IgG抗体水平,并分析载体诱导的免疫抑制率。结果所制备的多糖衍生物GAMP-ADH及多糖-蛋白结合物GAMP-ADH-Pep10均具有GAMP抗原特异活性,免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的GAMP血清IgG抗体,且接近GAMP-ADH-TT疫苗诱生的抗体水平,并能形成免疫记忆。重组蛋白Pep10诱导的免疫抑制率远低于TT诱导的免疫抑制率。结论制备的重组蛋白Pep10与A群脑膜炎球菌多糖偶联能发挥较强的载体效应,为研究理想载体蛋白提供了新的思路。

离子色谱法测定ACYW135群脑膜炎球菌结合物中Y群及W135群多糖含量

目的：利用离子色谱法即高效阴离子交换柱层析—脉冲安培检测法（ HPAEC-PAD）,测定ACYW135脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群多糖含量的方法,并加以验证。方法将ACYW135脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群多糖用三氟乙酸（ TFA）水解为特异性单糖（葡萄糖、半乳糖）,并去除水解液中残留的TFA,用HPAEC-PAD分析检测,用PA10糖分析柱分离单糖,电化学检测器测定葡萄糖及半乳糖含量,用Chrome-leon色谱工作站记录并分析数据。对上述方法进行专属性、准确性、重复性验证,确定该方法的检出限和定量限。结果 Y群和W135群多糖在TFA2.5 mol/L（终浓度）、90℃、4 h可完全水解为葡萄糖、半乳糖。对照品葡萄糖及半乳糖在0.10-60.00μg/mL 范围内,质量浓度和色谱峰面积呈较好的线性关系, r 均大于0.99,回收率为87.94%-109.80%,相对标准偏差（RSD）为1.00%-2.00%,检出限为0.05μg/mL（信噪比3∶1）,定量限为0.10μg /mL（信噪比10∶1）。结论离子色谱法可同时检测脑膜炎球菌多糖蛋白结合物中Y群和W135群糖含量,该方法操作简便、灵敏、快速,干扰小,重现性好,适用于对相关疫苗生产过程中的质量控制。

A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖测定方法的建立

本文建立一种测定A群脑膜炎球菌多糖 破伤风类毒素 (PS TT)结合物中游离多糖的方法。用 80 %乙醇使PS TT结合物沉淀 ,再用 6 0 %乙醇洗涤沉淀使未结合多糖溶解 ,使与TT结合的和未结合的多糖分离并分别测定。该方法可有效分离结合的与未结合的多糖并分别测定 ,结合物中外加多糖可定量回收。本方法适用于测定A群脑膜炎球菌多糖

顶空气相色谱法测定四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环

目的建立并验证四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环的检测方法。方法采用顶空气相色谱法,样品中加入碳酸钠固体,产生"盐析"效应,以增加二氧六环在顶空瓶中的浓度。通过HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm,5%Phenyl Methyl-Siloxane),氢火焰检测器测定四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环。结果二氧六环平均回收率及变异系数分别为86.16%～106.54%和2.4%～8.7%,在0.5004～40.032mg/L范围内相关系数值r=0.999 41,线性关系好,最低检测限为0.5 mg/L,最低定量限为2.5 mg/L。结论该方法溶剂用量少、灵敏度高、出峰特异、专属性强、色谱峰型好、分离度高、出峰时间短、影响因素少,是一种易于实现仪器自动化的分析方法。

脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗研究进展

流行性脑膜炎是细菌性脑脊髓膜炎中唯一能造成流行的疾病,可引起相当高的病死率和致残率。流脑从病原体的发现至今已超过100年,呈世界范围分布,全世界每年流脑病例可达30万到35万,是世界范围的一个严重公共健康问题。

C群脑膜炎球菌结合物小鼠免疫原性的研究

目的比较C群脑膜炎球菌多糖蛋白质结合物(简称结合物)的相对分子质量大小和免疫剂量对其在小鼠体内免疫原性的影响,为结合物的分子大小的质控和结合疫苗成品免疫剂量的选择提供实验依据。方法利用CDAP活化法制备C群脑膜炎球菌结合物,通过硫酸铵盐析进行纯化,然后利用Sepharose CL-4B凝胶过滤层析分析,并根据化学检测结果将结合物分为KD0-0.2(组分1)、KD0.2-0.4(组分2)、KD0.4-0.7(组分3)等3个不同相对分子质量组分,每份分别采用1.0μg、0.2μg的免疫剂量免疫小鼠,并对血清进行ELISA分析。结果采用1.0μg免疫剂量时,3种不同相对分子质量的C群脑膜炎球菌结合物均能产生较高水平的抗体,具有典型的加强效应,第2剂免疫即可产生高水平的抗体,而第2、3剂免疫后的抗体水平差异无统计学意义;采用0.2μg免疫剂量时,三种不同相对分子质量的C群脑膜炎球菌结合物只有在第3剂免疫后才能产生较高水平抗体,第1、2剂免疫后的抗体水平差异无统计学意义,组分1和组分2在第3剂免疫后产生的抗体水平优于组分3;对于相同相对分子质量结合物,用1.0μg免疫小鼠产生的抗体水平优于0.2μg免疫组,而且有显著的统计学意义。结论高剂量时,多糖相对分子质量大小对C群脑膜炎球菌结合物的免疫原性没有显著性影响;低剂量时,小相对分子质量结合物对其免疫原性有影响。同等相对分子质量时,1.0μg比0.2μg的免疫剂量可以激发更高的抗体水平。

SEA为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物初步免疫效果评价

目的对以金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物的免疫效果进行初步评价。方法采用1-氰基-4-二甲氨基-砒啶四氟硼酸(1-cyano-dimethylamino pyridiniumtetrafluoroborate,CDAP)活化法,将SEA、破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)分别与A群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group A N.meningitidis capsular polysaccharide,GAMP)、C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group C N.meningitidis cap-sular polysaccharide,GCMP)结合制备结合物;将结合物分别免疫BALB/c小鼠,腹部皮下免疫3次,于第1针免后第9天、第19天、第27天眼眶采血,分离血清备用;检测体液免疫及细胞免疫反应水平。结果 SEA与GAMP结合后能增强抗-GAMP Ig G抗体水平,第3次免后GAMP-SEA组多糖抗体水平达到1∶12 800,高于GAMP组1∶400,但GCMP-SEA组结果不理想。SEA与GAMP结合后均能激发细胞免疫反应,IFN-γ和IL-4的SFC与GAMP组比较均升高,且IFN-γ高于IL-4。SEA与GAMP、GCMP结合后Th1/Th2细胞亚群比值分别达到23.48和22.19,高于GAMP组(14.09)和GCMP组(16.73),差异有统计学意义(P<0.05),提示SEA与GAMP、GCMP结合后可激发细胞免疫。结论 SEA与GAMP、GCMP结合后既能增强GAMP、GCMP的免疫原性,提高体液免疫反应,又能激发细胞免疫反应,提示SEA具备作为A/C群脑膜炎奈瑟菌结合疫苗载体蛋白的可行性。

b型流感嗜血杆菌奈瑟球菌荚D蛋白作为载体的膜多糖C群脑膜炎-蛋白结合物的免疫效果评价

目的对b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)D蛋白(protein D,PD)作为载体的C群脑膜炎奈瑟球菌荚膜多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)-蛋白结合物进行免疫效果评价,以确定PD作为GCMP蛋白载体的可行性。方法采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(CDAP)活化法,将重组PD、破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)分别与GCMP结合制备结合物;将GCMP及结合物分别经腹部皮下免疫雌性BALB/c小鼠,分为GCMP、GCMP-PD、PD、GCMP-TT、TT及阴性对照(生理盐水)组,每组12只,共免疫3次,分别于每次加强免疫前及末次免疫后7 d,经眼眶采血,分离血清,用于抗体水平检测及血清杀菌力试验(serum bactericidal assay,SBA);同时在末次免疫后7 d取脾脏,进行细胞免疫水平检测。结果蛋白与GCMP结合后能增强抗-GCMP抗体IgG水平,第3次免疫后,与单独GCMP组相比,GCMP-PD和GCMP-TT组小鼠血清抗-GCMP IgG水平均显著升高(F分别为5.294、14.917,P均<0.05),且产生免疫记忆,诱导IgG1产生,但GCMP-PD组低于GCMP-TT组(F=5.828,P<0.05);CMP-PD、PD组小鼠血清抗-PD IgG抗体水平各次免疫后均显著增长,第3次免疫后,GCMP-PD组抗-PD IgG抗体水平显著高于PD组(F=15.426,P<0.01),而GCMP-TT组低于TT组(F=211.207,P<0.001)。SBA结果显示,GCMP-PD组杀菌抗体滴度高于GCMP组(F=11.797,P<0.05),但低于GCMP-TT组(F=8.688,P<0.05)。流式细胞术结果显示,GCMP-PD组Th1、Th2细胞亚群比值与GCMP及GCMP-TT组相比,差异均无统计学意义(F分别为0.073、3.021,P均>0.05)。结论重组PD与GCMP结合后,既能增强多糖疫原性,提高体液免疫反应能力,也能激发细胞免疫反应,同时免疫后血清杀菌效果显著,提示PD具备作为GCMP蛋白载体的可行性。

脑膜炎球菌疫苗多糖及多糖蛋白结合物分子量尺寸排阻色谱-多角度激光光散射联用检测方法的建立及验证

目的建立尺寸排阻色谱-多角度激光光散射(size exclusion chromatography-multiangle laser-light scattering,SEC-MALLS)联用测定脑膜炎球菌多糖及多糖蛋白结合物分子量的方法,并进行验证及初步应用,以期进一步提高该品种质量控制水平。方法建立SEC-MALLS联用方法检测脑膜炎球菌多糖及多糖蛋白结合物分子量,色谱条件:流动相为0.9%氯化钠溶液,色谱分离柱为Shodex OHpak LB-806 HQ(300 mm×8.0 mm,13μm),流速为0.5 mL/min,柱温为35℃。对方法的系统适用性、准确性、精密性、耐用性进行验证,并用该方法检测不同厂家来源的样品,同时与现行药典质量标准方法进行相关性分析。结果普鲁兰糖标准品除STD P-100以外,STD P-50 STD P-800重均分子量(Mw)实测值与标示值相对误差和精密度小于5.0%,可作为系统适应性样品;重复性、中间精密度RSD均不大于5.0%。多糖及多糖蛋白结合物在配制完成48 h内稳定性良好。A、C、Y、W135群多糖平均Mw分别为257.5、377.3、399.7、305.5 kDa;A、C群多糖蛋白结合物分别为6438、23360 kDa。71批多糖样品中有5批次A、C群结果超趋势,其余批次批内和批间差异均在均值±3 SD的范围以内。SEC-MALLS法与现行药典质量标准方法测定结果除Y群多糖分配系数(KD)与Mw呈一定的负相关性外,两种方法在其余多糖及多糖蛋白结合物中相关性并不显著。结论SEC-MALLS方法能直接测定脑膜炎球菌疫苗多糖及多糖蛋白结合物分子量,具有操作简单、快速、准确、能一定程度反映分子结构信息等优点,有利于提升该关键质量参数的质量控制水平。

不同剂量肺炎链球菌荚膜多糖与蛋白结合物的免疫原性比较

用肺炎链球菌 19F型、2 3F型的荚膜多糖 (C PS)分别和破伤风类毒素 (TT)蛋白结合 ,制备了两个型别的多糖 蛋白结合物 (19F TT ,2 3F TT)。为探讨结合物的最适免疫剂量 ,以 10 μg多糖和含 1μg、3 μg、9μg、2 7μg多糖的结合物经腹腔免疫NIH小鼠 ,ELISA方法检测小鼠血清中多糖和含不同多糖的结合物所产生的特异性IgG抗体。结果在不同的剂量免疫小鼠后 ,3 μg剂量组在免疫三针后可诱生高浓度的抗体 ,但随着免疫剂量的增加 ,9μg与 2 7μg诱生的抗体浓度较 3 μg诱生的抗体浓度之间并无显著性差异。含多糖 3 μg的 19F型和 2

C群脑膜炎球菌多糖纯化方法的改进

将C群脑膜炎球菌粗多糖的纯化改进为用1:1容量冷酚提取的生产工艺。结果表明,改进后的方法去除蛋白质效果同样能够达到《中国药典》2005版(三部)的要求,总体结果优于改进前。同时能扩大处理量而降低了生产成本,适合规模化生产。

脑膜炎双球菌蛋白菌苗和多糖菌苗中脂多糖(内毒素)的测定

脂多糖(LPS)、荚膜多糖(PS)、外膜蛋白(OMP)和伞毛(菌毛)是革兰氏阴性菌细胞表面抗原。由于LPS有各种毒性反应故称之为内毒素。除LPS外,其它表面抗原可用来制造菌苗。脑膜炎双球菌荚膜多糖菌苗和外膜多糖菌苗已用于预防脑膜炎双球菌感染。当非肠道使用的脑膜炎荚膜多糖(PS)菌苗、沙门氏伤寒ViPs菌苗和脑膜炎蛋白(OMP)菌苗含有LPS时,会引起发烧和其它反应。而对于OMP菌苗要想不使蛋白抗原变性而彻底除去LPS是不可能的。所以,菌苗中的LPS应设法降低其含量达不至于引起发烧或其它异常反应的水平。在这些制品的质量检定中,—个特定剂量的家兔热原试验应为阴性。

肺炎链球菌18C型糖蛋白结合物的制备及其免疫原性

制备肺炎链球菌 18C型荚膜多糖 破伤风类毒素结合物 (CPS TT) ,测定结合物的理化性质、抗原特异性及其在动物中的免疫原性。结果显示 ,结合物能与相应的多糖和破伤风抗血清形成明显的沉淀线 ,蛋白 /多糖比率为 1.86 ,结合物分子大小 (Kd值 )为 0 .0 5 8。注射小鼠后可诱导明显的抗体应答 ,而且随着注射针次的增加 ,抗体反应水平明显增高 ,显示加强效应。结果表明 ,制备的肺炎链球菌糖蛋白结合物抗原性良好 ,具有胸腺依赖性抗原的特性 。

A群脑膜炎球菌多糖—精破类偶联抗原的制备及其主要特性

参照生物制品质量要求,连续制备3批脑膜炎球菌多糖-精破类偶联抗原,其多糖含量为19.8～24.4%(w/w),该种拟糖蛋白具有波长为245nm特征性的紫外光吸收谱,在Sepharose-CL 4B柱层析上Kd为0。偶联抗原中多糖的抗原性在火箭电泳上虽与单纯多糖相似,但其免疫原性则明显增强。偶联抗原在4℃存放3年或在37℃存放8周,其免疫原性无明显改变。加温处理过的偶联抗原经Sepharose-CL4B和SDSPAGE检查表明,多糖与蛋白共价结合是相当稳定的。

细菌内毒素对A群C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖蛋白质含量测定结果的影响

目的 探究Lowry法测定A群C群脑膜炎奈瑟菌(简称脑膜炎球菌)多糖原液蛋白质含量时,细菌内毒素对Lowry法的干扰情况。方法 根据《中华人民共和国药典》2015版(三部)规定的方法,测定含不同浓度的细菌内毒素的A群C群脑膜炎球菌多糖原液的蛋白质含量,对检测结果进行分析。以细菌内毒素为干扰物质,设计3种方法进行验证,对验证结果进行离散系数,即CV值分析,确定干扰限值。结果 当细菌内毒素含量较高时,A群C群脑膜炎球菌多糖原液的蛋白质含量明显增高,该结果可能为假阳性。验证试验结果显示,当溶液中细菌内毒素浓度达到0.313EU/mL时,会对检测结果产生干扰,浓度越高,干扰程度越高。结论 为获得准确的检测结果,当细菌内毒素浓度达到干扰限值时,应先消除干扰,再测定蛋白质含量。

不同酸水解酪蛋白对W135群和Y群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖产量的影响

目的 探索不同酸水解酪蛋白对W135群与Y群脑膜炎奈瑟菌(脑膜炎球菌)荚膜多糖产量的影响。方法 分别以NaCl质量分数为37%和14%的酸水解酪蛋白作为有机氮源配制改良半综合高盐培养基和低盐培养基,利用全自动细菌发酵罐分别在两种培养基里培养W135群和Y群脑膜炎球菌,比较这两种菌株在两种培养基中的生长时间、收获液菌密度( A 600 nm 值)、收获液去菌体后与去复合多糖后上清中的荚膜多糖含量,以及纯化后的精糖产量;比较高盐培养基收获液及其2倍稀释液中不同终含量的十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)溶液对多糖沉淀效果的影响。结果 W135群与Y群脑膜炎球菌在两种培养基中的培养时间差异无统计学意义( P >0.05),但高盐培养基收获液的菌密度、收获液去菌体后上清液中的多糖含量均高于低盐培养基收获液,差异有统计学意义( P < 0.05),而高盐培养基收获液纯化后的精糖产量低于低盐培养基,差异有统计学意义( P <0.05)。高盐培养液2倍稀释后,在CTAB终体积分数为0.04%时,W135群与Y群脑膜炎球菌多糖全部沉淀,而未稀释高盐培养液即使CTAB终体积分数提高到0.14%,依然也不能完全沉淀 W135群与Y群脑膜炎球菌多糖。结论 不同酸水解酪蛋白对W135群和Y群脑膜炎球菌的生长密度和荚膜多糖产量有影响,用CTAB溶液沉淀荚膜多糖时需控制收获液盐含量。

9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物中游离多糖去除方法的筛选及优化

目的筛选一种有效去除9V型肺炎球菌(Pn9V)多糖蛋白结合物中游离多糖的方法,并进行工艺优化及稳定性验证,以期用于多价肺炎结合疫苗的制备。方法制备Pn9V-CRM197结合物,分别采用分子筛(Sepharose 4FF)、离子交换层析(DEAE Sepharose FF)、疏水层析(GP-Butyl)及硫酸铵(ammonium sulfate,AS)盐析法去除结合物中的游离多糖,通过比较游离多糖百分比、多糖回收率及蛋白回收率筛选最适方法,并对确定的方法进行工艺优化。连续制备3批结合物,验证工艺的稳定性。结果疏水层析和离子交换层析均可将Pn9V-CRM197结合物的游离多糖降至5%以下,疏水层析多糖及蛋白回收率(34.7%和50.1%)高于离子交换层析(16.2%和25.7%),选择疏水层析去除结合物中的游离多糖。优化的工艺为1.1 mol/L AS上样,注射用水洗脱,层析载量为1.81 mg蛋白/mL填料。连续制备的3批结合物游离多糖去除率、多糖回收率及蛋白回收率良好,且批间一致性高;2~8℃放置6个月,结合物稳定性良好,(25±2)℃放置6个月,游离多糖百分比显著增加(F=5.83 e-32,P=0.003),且>25%,不适宜高温保存。结论建立了有效去除Pn9V蛋白结合物中游离多糖的疏水层析工艺,该工艺稳定性良好,也为其他型别肺炎球菌多糖蛋白结合物游离多糖的去除提供了参考。