CXCL1通过促进蛋白激酶B磷酸化导致bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞骨架收缩和通透性增加

目的探讨脓毒症脑病炎症中CXC趋化因子配体1(CXCL1)及其受体CXC趋化因子受体2(CXCR2)对脑内皮细胞骨架重排和通透性的影响及其相关机制。方法野生型小鼠腹腔注射脂多糖(LPS)(10 mg/kg)建立脓毒症脑病模型,ELISA检测全脑组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)和CXCL1含量。使用500 ng/mL LPS和200 ng/mL TNF-α刺激bEND.3脑微血管内皮细胞后,Western blot法检测细胞CXCR2的表达。以150 ng/mL CXCL1刺激bEND.3细胞,免疫荧光染色观察脑内皮细胞骨架纤维型肌动蛋白(F-actin)重排的变化。脑内皮细胞通透性实验中,将bEND.3细胞随机分为PBS对照组、CXCL1组、CXCL1联合选择性CXCR2拮抗剂SB225002组,Transwell^(TM)小室检测各组通透性变化情况。CXCL1刺激bEND.3细胞后,Western blot法检测细胞中蛋白激酶B(AKT)和磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达。结果腹腔注射LPS导致小鼠全脑组织中TNF-α和CXCL1水平显著升高;LPS和TNF-α刺激可增高bEND.3细胞CXCR2蛋白的表达。CXCL1刺激bEND.3细胞使其细胞骨架收缩,细胞间隙形成增加,且细胞渗透性增加,而CXCR2拮抗剂SB225002预处理可显著抑制CXCL1引起的脑内皮细胞肌动蛋白应力纤维和细胞间隙的形成、以及通透性的增高,同时CXCL1(150 ng/mL)刺激使得脑内皮细胞AKT的磷酸化水平明显升高。结论CXCL1通过AKT磷酸化激活引起脑内皮细胞骨架收缩、细胞通透性增加,CXCR2拮抗剂SB225002可有效抑制CXCL1诱导的细胞骨架收缩和通透性升高。

小鼠脑微血管内皮细胞株bEnd.3的细胞特征及基因表达谱分析

目的 :对一种小鼠脑组织来源的血管内皮细胞株bEnd .3的主要细胞特征进行研究并做血管内皮细胞生物学功能基因芯片分析。方法 :利用倒置显微镜、扫描和透射电子显微镜观察细胞形态特征 ;免疫细胞化学法显示血管内皮细胞特异性表面标志 ;ELISA定量检测PGE2 ;流式细胞术、MTT法研究增殖和凋亡、血管内皮细胞基因芯片研究正常培养bEnd 3基因表达谱。结果 :bEnd 3具备多种典型的微血管内皮细胞 (MVEC)特征 :细胞呈多边形或梭型、呈铺路石样生长 ;存在管腔样结构 (TLS)和毛细血管样网络 ,细胞表面有丰富的微绒毛 ;vW因子、CD34阳性 ;CD31、CD36、CD10 5等也有不同程度的表达 ;细胞高水平分泌前列腺素E2 (PGE2 ) ;多种与正常血管功能密切相关的基因也有不同程度的表达。结论 :bEnd .3保留了MVEC的基本特性 ,可用于心脑血管疾病。

长链非编码RNA MEG3调控miR-21表达影响过氧化氢诱导的脑血管内皮细胞凋亡

目的长链非编码RNA(LncRNA)母系表达基因(MEG)3调控miR-21表达对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的脑血管内皮细胞凋亡的影响。方法RT-PCR测定H_(2)O_(2)处理后的脑血管内皮细胞中MEG3表达变化。在脑血管内皮细胞中转染MEG3 shRNA,经H_(2)O_(2)处理,流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、酶切caspase-9蛋白及miR-21表达变化。在脑血管内皮细胞中共转染MEG3 shRNA和miR-21 inhibitor,利用上述方法测定细胞凋亡和酶切caspase-3、酶切caspase-9蛋白表达。结果H_(2)O_(2)组MEG3水平显著高于Normal组(P<0.05)。sh-MEG3+H_(2)O_(2)组MEG3水平显著低于sh-NC+H_(2)O_(2)组(P<0.05)。与Normal组比较,H_(2)O_(2)组细胞凋亡率、酶切caspase-3、酶切caspase-9水平均显著升高(P<0.05);与sh-NC+H_(2)O_(2)组比较,sh-MEG3+H_(2)O_(2)组细胞凋亡率、酶切caspase-3、酶切caspase-9蛋白水平均显著下降(P<0.05)。Normal组miR-221水平显著高于H_(2)O_(2)组(P<0.05);sh-NC+H_(2)O_(2)组miR-21水平显著低于sh-MEG3+H_(2)O_(2)组(P<0.05)。sh-NEG3+anti-NC+H_(2)O_(2)组miR-21水平显著高于sh-MEG3+anti-miR-21+H_(2)O_(2)组(P<0.05)。与sh-MEG3+anti-NC+H_(2)O_(2)组比较,sh-MEG3+anti-miR-21+H_(2)O_(2)组凋亡率、酶切caspase-3、酶切caspase-9均显著升高(P<0.05)。结论LncRNA MEG3调控miR-21表达影响H_(2)O_(2)诱导的脑血管内皮细胞凋亡。

健脾补肾活血方含药血清调控PI3K/Akt信号通路影响大鼠内皮祖细胞功能的机制

目的探讨健脾补肾活血方含药血清影响大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)增殖、迁移、成管功能的机制,以期为该方治疗缺血性脑血管病提供理论依据。方法SD大鼠12只,随机分为两组:中药组和对照组,每组6只。分别给予每毫升含生药为3.25 g健脾补肾活血方颗粒药液和CMC-Na溶液灌胃,采集血清,组内混合,保存备用。SD大鼠2只,取骨髓EPCs,并培养、鉴定。将EPCs随机分为8组:空白组(KB),低、中、高浓度含药血清组(Lx、Mx、Hx),PI3K抑制剂组(PI),低、中、高浓度含药血清+PI3K抑制剂组(Lp、Mp、Hp)。分别给予同等体积的对照组混合血清,10%、20%、40%浓度中药组混合含药血清,30μmol·L^(-1)浓度LY294002,10%、20%、40%浓度中药组混合含药血清+30μmol·L^(-1)浓度LY294002。Western blot、CCK8、Tranwell、体外成血管试剂盒分别检测各组EPCs p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K的相对蛋白表达量、增殖、迁移、成管能力。结果与空白组(KB)比较,健脾补肾活血方低、中、高浓度含药血清组(Lx、Mx、Hx)EPCs p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K的相对蛋白表达量、增殖、迁移、成管能力明显提高(P<0.05)。PI3K抑制剂组(PI)和空白组(KB),低、中、高浓度含药血清+PI3K抑制剂组(Lp、Mp、Hp)和与之分别对应的Lx、Mx、Hx组相比较,EPCs p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K的相对蛋白表达量、增殖、迁移、成管能力明显下降(P<0.05)。结论健脾补肾活血方可调控PI3K/Akt信号通路提高大鼠骨髓源EPCs增殖、迁移及成管能力。

烟碱对白细胞介素-1β诱导的培养牛脑微血管内皮细胞表达α_vβ_3整合素的增强作用

目的观察烟碱对牛脑微血管内皮细胞（Bovine cerebral microvascular endothelial cells,ＢＣＭＥＣ）表达αvβ3整合素 的影响。方法离体培养新生牛脑微血管内皮细胞；血细胞计数仪测定ＢＣＭＥＣ粘附大鼠血单核细胞（ＭＮ）的数目；应用 ＥＬＩＳＡ法检测ＢＣＭＥＣ对αvβ3整合素的表达量。结果高浓度烟碱（１０－５mol/L)单独作用于ＢＣＭＥＣ２h后，使ＢＣＭＥＣ 对 ＭＮ的粘附率从（１２．９＋０．４）％增至（１５．７＋０．６）％，且 ＢＣＭＥＣ也可表达少量的 αvβ３整合素；而当烟碱与ＢＣＭＥＣ作用２ ｈ后，再经白细胞介素－１β（ＩＬ－１β）诱导４ｈ，烟碱可浓度依赖性（１０－７～１０－５mol/L）地增强ＩＬ－１β的诱导作用，增加ＢＣＭＥＣ 对ＭＮ的粘附率以及Ｅ－选择素的表达量；抗αvβ3整合素抗体（αβＡＩＡb）能显著阻断ＩＬ－１β诱导ＢＣＭＥＣ后对ＭＮ的粘 附率。结论烟碱具有增强ＩＬ－１β诱导的脑微血管内皮细胞表达αvβ３整合素的作用。

基于SIRT1/VEGFA信号通路探讨川芎嗪调节缺血性脑卒中损伤后血管内皮细胞的新生作用研究

该文研究川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)能否通过刺激脑微血管内皮细胞促进血管新生,缓解缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke, CIS)并探讨其作用机制。体内实验:成年sprague-dawley(SD)大鼠,假手术(sham)组、大脑中动脉闭塞再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R)组、MCAO/R+TMP组(腹腔注射20 mg·kg^(-1))。采用Z-Longa法评估神经功能;TTC染色检测脑梗死体积,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血管生成素(angiopoietin, Ang)和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF);免疫荧光检测Ki67、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、沉默信息调节因子1(slient information regulator 1,SIRT1);蛋白免疫印迹法(Western blot)检测VEGFA、SIRT1、血管生成素-2(angiopoietin-2,Ang-2)和血小板衍生生长因子B(platelet-derived growth factor B,PDGFB)。体外实验:培养小鼠脑微血管内皮细胞(brain-derived endothelial cells.3,Bend.3),确定TMP的最佳药物浓度;加入血管新生抑制剂卡博替尼(cabozantinib, BMS),ELISA检测VEGF、Ang和PDGF;Western blot检测VEGFA、Ang-2和PDGFB;免疫荧光染色检测CD31、CD34、Ki67;成管实验观察Bend.3细胞增殖、迁移和管腔形成的能力。加入SIRT1特异性抑制剂selisistat (EX-527)检测SIRT1和VEGFA的蛋白和免疫荧光,观察TMP对SIRT1/VEGFA通路的调控。结果显示,在体内实验中与sham组相比,MCAO/R组神经功能受损严重,脑梗死体积增大,VEGF、VEGFA、Ang、Ang-2、PDGF和PDGFB表达上升,Ki67和SIRT1表达下降(P<0.01)。与MCAO/R组相比,MCAO/R+TMP组神经功能受损症状改善、脑梗死体积明显缩小,激活了VEGF、VEGFA、Ang、Ang-2、PDGF和PDGFB、Ki67和SIRT1表达(P<0.01)。体外实验中发现与sham组相比,Bend.3细胞经糖氧剥夺复糖氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)处理后被激活(P<0.05,P<0.01)。与OGD/R组相比,OGD/R+TMP组VEGF、VEGFA、Ang、Ang-2、PDGF、PDGFB、SIRT1、Ki67、CD31和CD34的表达水平上调,Bend.3细胞的成管能力增强,同时不受BMS和EX-527的抑制作用(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。由此表明,TMP能通过激活SIRT1/VEGFA通路,刺激血管新生,缓解CIS损伤。

活血定眩胶囊对小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3基因表达谱的影响及生物信息学分析

目的探讨活血定眩胶囊含药血清对体外培养小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3基因表达谱的影响及作用的分子机制。方法将30只大鼠随机分为对照组和活血定眩胶囊组,2组分别ig给予7.5 g/kg活血定眩胶囊和等量生理盐水,连续7 d,采集2组大鼠血清。将bEnd.3细胞分为对照组、模型组、10%活血定眩胶囊含药血清组,给药后,bEnd.3细胞缺氧6 h。激光显微镜下观察细胞骨架,运用Affymetrix U133 plus2.0基因组表达芯片检测活血定眩胶囊对bEnd.3细胞基因表达谱的影响,应用分子注释系统MAS3.0软件进行聚类分析。结果根据P<0.01,|Fold Change|>3筛选差异基因,对照组与模型组之间共有405个差异基因,其中表达上调的有176个,表达下调的有229个。活血定眩胶囊含药血清组与模型组之间共有368个差异基因,其中表达上调的有146个,表达下调的有222个。这些共同的差异基因生物功能包括内皮细胞迁移的正调控、含氧酸代谢过程、血管内皮生长因子的产生、核转录因子-κB(NF-κB)活性的正向调节等,参与的信号通路包括氧化应激诱导的衰老、有丝分裂前期、血小板聚集(堵塞形成)、血管内皮生长因子信号通路、白细胞介素信号通路、p53通路、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、凋亡信号通路等信号通路。结论活血定眩胶囊对缺氧所致bEnd.3细胞的损伤具有明显的对抗作用,其机制与氧化应激、抑制细胞凋亡、促进血管内皮新生、炎症及免疫反应有关,活血定眩胶囊在基因水平通过多条通路调节血管内皮细胞功能。

人参皂苷对大鼠脑血管内皮细胞MEG3表达的干预作用及促进血管新生的研究

目的:观察人参皂苷(GS)对大鼠脑血管内皮细胞长链非编码RNA maternally expressed 3(MEG3)表达和血管新生的影响。方法:将大鼠脑微血管内皮细胞系(RBE4)培养在内皮细胞培养基中,分为Control组MEG3 siRNA组和GS组。实时荧光定量PCR法检测GS对RBE4的MEG3、血管内皮生长因子A(VEGFA)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)基因表达量的影响。Western Blot检测GS对RBE4细胞VEGFA和VEGFR2蛋白表达量的影响。同时观察GS对RBE4细胞迁移和成管能力的影响。结果:与Control组比较,MEG3 siRNA组和GS组显著降低了MEG3的基因表达量(P<0.01),同时提高了VEGFA和VEGFR2的基因(P<0.01)和蛋白的表达量;RBE4的迁移能力和成管能力都显著增强(P<0.01,P<0.05)。结论:GS通过降低RBE4MEG3的表达量,从而上调VEGFA、VEGFR2的表达,并显著促进了血管新生。

活血定眩胶囊含药血清对小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3自噬的影响

目的:探讨活血定眩胶囊含药血清对氧糖剥夺损伤(OGD)培养的bEnd.3细胞自噬的干预情况。方法:制备各大鼠含药血清,将bEnd.3细胞传代培养并建立OGD模型后,将其分为OGD模型组,活血定眩胶囊含药血清低、中、高剂量组及盐酸氟桂利嗪组,取bEnd.3细胞为对照组,进行相应的方法干预,干预后检测各组细胞丙二醛(MDA)浓度、乳酸脱氢酶(LD)活性,激光共聚焦扫描显微镜分析LC3点状聚集计数并计算灰度值,qRT-PCR方法检测自噬相关基因LC3Ⅱ、P62、Beclin-1 mRNA的表达。结果:与对照组比较,OGD模型组MDA浓度、LD活性、LC3Ⅱ表达量及LC3Ⅱ、P62、Beclin-1 mRNA表达均显著升高(P<0.05);与OGD模型组比较,经活血定眩胶囊含药血清中、高剂量干预后,各组MDA浓度、LD活性、LC3Ⅱ表达量及LC3Ⅱ、P62、Beclin-1mRNA表达显著降低(P<0.05);与其他各干预组比较,活血定眩胶囊含药血清中剂量组上述指标改善较明显(P<0.05)。结论:活血定眩胶囊含药血清可通过调节血管内皮细胞适度自噬而减轻内皮细胞损伤,是活血定眩胶囊治疗椎动脉型颈椎病的机制之一。

野黄芩素改善高糖诱导小胶质细胞活化引起的血脑屏障功能障碍

目的研究野黄芩素(scutellarein)对高糖诱导的小胶质细胞活化引起的血脑屏障功能障碍的改善。方法将神经小胶质细胞BV-2与小鼠脑血管内皮细胞bEnd.3共培养,建立血脑屏障细胞模型。跨内皮电阻实验和细胞渗漏实验检测内皮细胞屏障的损伤情况;酶联免疫吸附法测定BV2细胞上清中TNF-α的含量;免疫印迹法检测bEnd.3细胞中紧密连接蛋白,包括occludin、claudin1、claudin5和claudin19的表达。结果用高糖诱导活化BV-2细胞或用TNF-α直接刺激bEnd.3细胞都会损伤bEnd.3细胞构成的细胞屏障,野黄芩素可逆转这种损伤。野黄芩素可以减少高糖诱导活化的BV-2细胞中TNF-α的分泌。TNF-α可以降低bEnd.3细胞中紧密连接蛋白claudin1、claudin5和claudin19的表达,野黄芩素能够逆转TNF-α降低的claudin1和claudin19蛋白表达。结论野黄芩素可以阻断高糖诱导的神经小胶质细胞活化,减少炎性因子TNF-α的释放,缓解高糖诱导激活神经小胶质细胞和TNF-α直接刺激脑血管内皮细胞所导致的血脑屏障破损。