小鼠脑血管平滑肌细胞和内皮细胞的联合提取与鉴定

[目的]建立一种高效且稳定的原代小鼠脑血管平滑肌细胞和内皮细胞的分离方法,为脑血管病发病机制和治疗方法的探究提供实验材料。[方法]通过葡聚糖梯度离心联合酶消化法分离脑血管平滑肌细胞,再通过免疫磁珠分选分离脑血管内皮细胞。使用倒置相差显微镜观察两种细胞的形态和生长特征,通过免疫荧光鉴定纯度,通过CCK-8法观察传代后生长和增殖特性。在细胞功能层面,通过血管形成实验评估内皮细胞血管形成能力,通过迁移实验评估平滑肌细胞对血小板源性生长因子(PDGF)的反应性。[结果]采用本方法分离出的两种细胞生长旺盛,状态良好。平滑肌细胞表现出典型的“峰谷状”生长,免疫荧光结果显示胞质内平滑肌特异性α-SMA和SM22α表达阳性;内皮细胞表现出典型的“铺路石”样生长,血小板内皮细胞黏附分子CD31和闭锁小带蛋白1表达阳性。[结论]本研究建立了一种高效同时分离两种脑血管细胞的可靠方法,分离细胞纯度高,活性良好,且传代后特征稳定,足以满足后续实验需求。

急性缺氧致小鼠脑血管平滑肌功能改变的转录组学分析

目的探讨小鼠脑血管平滑肌细胞(CVSMCs)在低气压缺氧脑损伤中的作用及其可能的发生机制。方法将雄性C57BL/6J小鼠随机分为平原组(Sham组)和高原组(HA组),每组10只。采用HE染色、免疫组织化学法、免疫荧光法、Western blotting观察各组小鼠脑损伤以及脑血管平滑肌功能变化情况。分离培养另20只C57BL/6J小鼠的原代CVSMCs并构建细胞缺氧模型。采用RNA-seq技术对缺氧组(Hypoxia组)和常氧对照组(Control组)的细胞进行转录组测序,筛选出差异表达基因(DEGs)后进行GO富集分析和KEGG通路富集分析,并使用qRT-PCR对测序结果的准确性进行验证。结果模拟高原环境导致小鼠神经元损伤,并且这种损伤伴随脑血管平滑肌收缩功能改变;RNA-seq测序结果显示,Hypoxia组和Control组相比有511个DEGs(变化大于2倍;P<0.05),其中298个上调差异基因,213个下调差异基因。GO富集分析DEGs主要富集在线粒体结构功能以及糖代谢相关途径。在KEGG通路富集分析中,糖酵解/糖异生、氨基酸生物合成、RIG-I样受体信号通路较显著(P<0.05)。结论CVSMCs可通过改变能量代谢、物质代谢、信号传导等多个途径在低气压缺氧脑损伤中发挥作用。本研究为后续进一步研究CVSMCs在低气压缺氧脑损伤中的作用机制提供了新的方向和思路。

过氧亚硝酸盐增强人脑血管平滑肌细胞PDCD4基因表达

目的探讨过氧亚硝酸盐(ONOO-)诱导人脑血管平滑肌细胞(HCVSMCs)凋亡过程中PDCD4基因表达的变化。方法以体外培养的HCVSMCs系为实验材料,观察不同浓度的ONOO-对HCVSMCs的作用。采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,流式细胞仪测定细胞凋亡率,吖啶橙染色、Ho33342/PI荧光双染进行形态学观察,RT-PCR及Western blot检测PDCD4的mRNA及蛋白表达。结果ONOO-作用HCVSMCs 24 h,显著抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡,同时引起PDCD4mRNA及蛋白表达显著增加。结论PDCD4基因可能在ONOO-诱导HCVSMCs凋亡的信号传导通路中起到关键作用。

过氧亚硝酸盐作用于脑血管平滑肌细胞的研究进展

中风发生机制的研究一直是国内外研究的热点课题,值得关注的是,脑血管平滑肌细胞异常,尤其是过度凋亡,在中风等脑血管疾病发生过程中起了关键作用。血管壁的主要成分内皮细胞及平滑肌细胞易于受到细菌、病毒、自由基等一系列生物活性物质攻击,产生病理生理效应[1]。

TRPV4对脑血管平滑肌增殖及凋亡的影响

目的探究新型钙离子通道香草醛受体4(transient receptor potential vanilloid receptor,TRPV4)对自发性高血压(spontaneously hypertensive rats,SHR)大鼠脑血管平滑肌增殖及凋亡的影响。方法分离并培养大鼠脑基底动脉平滑肌细胞(basilar arterial smooth muscle cells,BASMCs),采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot)法检测细胞中TRPV4的表达。转染TRPV4 siRNA沉默TRPV4基因,CCK-8检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期及凋亡;Western blot检测cyclin D1、p-Rb、Bcl-2、cleaved-caspase-3/caspase-3、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β蛋白表达。结果 qRT-PCR及Western blot结果显示自发性高血压大鼠BASMCs中TRPV4的表达明显高于对照组大鼠。而在自发性高血压大鼠BASMCs中,沉默TRPV4可抑制细胞增殖,阻滞细胞周期并诱导其凋亡;此外还可下调cyclin D1、p-Rb、Bcl-2、p-AKT、p-GSK3β蛋白的表达,同时上调cleaved-caspase-3蛋白的表达。结论沉默TRPV4能够抑制自发性高血压大鼠BASMCs细胞增殖,同时促进细胞凋亡,机制可能与抑制AKT/GSK3β信号通路的激活有关,所以新型钙离子通道TRPV4可为今后靶向诊疗高血压脑血管疾病提供依据。

神经肽Y对蛛网膜下腔出血后脑血管平滑肌细胞增殖及α-actin表达的影响

目的观察神经肽Y(NPY)在蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管平滑肌细胞增殖及收缩蛋白表达变化,揭示NPY在SAH后迟发性脑血管痉挛中的作用。方法 SD大鼠150g,雌雄不拘,失血法处死并行生理盐水灌注,取大鼠Willis环动脉及其分支,行原代细胞培养并传代,向细胞培养基中加入自身全血使氧合血红蛋白终浓度达10-6mol/L以建立SAH血管痉挛平滑肌细胞模型并进行分组,包括空白组、SAH组、NPY组、NPY+SAH组、NPY+SAH+BIBO3304组(干预组)、NPY+BIBO3304组,培养1~5d后用免疫荧光法检测α-actin表达,IPP软件测荧光强度半定量,SPSS 16.0统计软件进行数据分析。结果应用消化法成功培养出血管平滑肌细胞(VSMCs),经细胞活度检查示活度>97%,经细胞纯化后细胞免疫染色未见其他种类细胞,经传代培养至第5代时可见细胞呈典型"谷-峰"样生长。细胞干预3d后NPY组与NPY+SAH组较SAH组与空白组α-actin荧光强度明显增强(P<0.05),而干预组与NPY+BIBO3304组α-actin荧光强度与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 NPY上调VSMCs的α-actin表达,而其受体拮抗剂BIBO 3304可阻断NPY上调α-actin作用。NPY在SAH后迟发性脑血管痉挛中发挥着重要作用。

慢病毒介导的HTRA1突变基因感染对人脑血管平滑肌细胞内氧化应激反应的影响

检测HTRA1及HTRA1-Mut基因慢病毒载体转染HBVSMC后,HBVSMC内氧化应激水平的变化。以HTRA1及HTRA1-Mut基因慢病毒载体转染HBVSMC后,在特定的时间点收集NC、OE-WT HTRA1及OE-MU HTRA1三组细胞的总RNA及总蛋白,分别用RT-PCR和Western Blot的方法检测三组细胞的NOX4 mRNA及蛋白水平的表达情况;用DCFH-DA法检测三组细胞内的活性氧水平。从定量PCR结果可以看出,人脑血管平滑肌细胞中,OE-MU组NOX4基因表达丰度是NC组的2.015倍。从Western blot结果可以看出,在正常的人脑血管平滑肌细胞中NOX4蛋白水平表达较低,而在慢病毒LV-HRTA1及LV-HRTA1-MUT感染后NOX4蛋白表达水平增高。在正常的人脑血管平滑肌细胞中ROS水平表达较低,而在慢病毒LVHRTA1及LV-HRTA1-MUT感染后ROS蛋白表达水平增高,在突变型病毒感染细胞组表现更为明显。说明:1HTRA1突变型基因感染人脑血管平滑肌细胞后,细胞内活性氧产量增加,NOX4 mRNA水平的表达正常细胞升高,但较HTRA1野生型基因无明显差别;NOX4在蛋白水平表达较其他两组均升高;2HTRA1突变型基因感染的人脑血管平滑肌细胞出现增殖减少、迁移活力降低以及凋亡增加可能与细胞内的氧化应激有关,为进一步研究CARASIL发病机制奠定基础。

脑血管平滑肌细胞分离培养与鉴定

目的；分离培养脑血管平滑肌细胞。方法：用组织块干涸法分离用养平滑肌细胞并进行光镜观察和免疫组化鉴定。结果：平滑肌细胞传代培养后经台盼蓝排斥实验，细胞的成活率达９５％，免疫组化鉴定培养细胞中的平滑肌细胞的纯度为９７％。平滑肌细胞呈梭形，可单层生长；也可多层重叠呈“谷、峰”状生长。结论：平滑肌细胞培养能为研究脑血管疾病提供良好的细胞。

羧基末端连接蛋白反应蛋白对脑血管平滑肌细胞氧化损伤的修复作用

目的观察羧基末端连接蛋白反应蛋白(CtIP)对脑平滑肌细胞氧化损伤的功能作用,并探讨其作用机制.方法通过添加三丁基过氧化氢(TBHP)刺激诱导脑平滑肌细胞氧化应激,采用过表达和干扰慢病毒技术制备CtIP基因表达和沉默表达细胞株,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光检测细胞的损伤程度,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞CtIP、α-SMA蛋白的表达,实时定量反转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)检测CtIP信号通路基因的表达,SPSS软件Student-t检验分析组间基因表达差异显著性.结果免疫荧光和Western blot检测结果显示,过表达CtIP后,α-SMA的表达减弱,血管平滑肌细胞损伤程度减轻.而干扰CtIP表达后,α-SMA表达显著增加,血管平滑肌细胞损伤程度提高.Real-time RT-PCR结果显示,CtIP基因显著上调BRCA1,ZBRK1和CDK4基因的表达,分别增加了2.04倍(t=-12.976,P<0.01)、2.72倍(t=-5.976,P<0.01)和2.08倍(t=-7.980,P<O.01),而抑制下调了p21基因的表达近2.05倍(t=10.936,P<0.01).结论 CtIP基因对损伤的脑平滑肌细胞具有显著的修复作用,并确定了CtIP基因与BRCA1,ZBRK1,CDK4和p21基因在损伤过程中的调控关系.

电针水沟穴对脑梗死模型大鼠脑血管平滑肌中L型钙通道α1C亚基及TRPC6亚基mRNA表达的影响

目的观察电针水沟穴对脑梗死模型大鼠脑血管平滑肌中细胞膜电压依赖性钙通道(VDCC)L型钙通道α1C亚基及受体门控钙通道(ROCC)瞬时受体电位通道6(TRPC6)亚基m RNA表达的影响。方法将130只SPF级雄性Wistar大鼠采用随机数字表法分为空白组(10只)、假手术组(40只)、模型组(40只)、电针组(40只)4组,除空白组外,其余3组又随机分为术后3 h、6 h、12 h、24 h 4个时相,每个时相10只。以线栓法复制大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠模型。电针组在造模后即刻针刺水沟穴,以韩氏电针仪刺激20 min。各组大鼠分别于相应时间处死,在外科显微镜下分别分离、剪取梗死侧的大脑前动脉、中动脉、后动脉各8 mm,通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测各组不同时相大鼠脑血管平滑肌中L型钙通道α1C亚基及TRPC6亚基m RNA的相对表达量。结果与空白组和假手术组比较,模型组各时相大鼠脑血管平滑肌中L型钙通道α1C亚基及TRPC6亚基m RNA相对表达量均明显上调,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,电针组各时相大鼠脑血管平滑肌中L型钙通道α1C亚基及TRPC6亚基m RNA相对表达量均明显下调,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论电针干预能显著抑制MCAO模型大鼠脑血管平滑肌中VDCC L型钙通道α1C亚基及ROCC TRPC6亚基m RNA表达的上调,从而抑制缺血后血管平滑肌痉挛,增加脑梗死区周围血流灌注。

慢病毒介导的HTRA-突变基因感染对人脑血管平滑肌细胞生物学特性影响

目的探讨HTRAJ基因及tfTRA，突变基因[1091T〉C（点突变）]慢病毒表达载体感染对人脑血管平滑肌细胞（HBVSMC）增殖、迁移及凋亡等生物学特性的影响。方法构建野生型HTRAJ基因及突变型HTRAJ基因慢病毒表达载体，并将其感染经培养和鉴定的HBVSMC，以空载体感染libVSMC为对照组。采用CCK-8法连续5d检测细胞增殖情况，Transwell实验检测细胞的迁移，流式细胞术检测细胞凋亡。结果与对照组相比，野生型HTRAI基因慢病毒组细胞增殖无明显变化，至第3天起突变型HTRAl基因慢病毒组细胞增殖减缓，差异具有统计学意义（P〈0．05）。对照组、野生型HTRAl基因慢病毒组、突变型HTRAI基因慢病毒组细胞迁移率分别为0．474±0．079、0．612±0．037、0．283±0．064，差异有统计学意义（p〈0．05）。与对照组细胞凋亡率（3．68％±0.23％）相比，野生型HTRAI基因慢病毒组细胞凋亡率（3．13％±0．07％1降低，差异有统计学意义（P〈0．05）；突变型HTRAI基因慢病毒组细胞凋亡率（3.70％±0.20％）增多不明显，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论突变型HTRAI基因感染HBVSMC后引起该细胞增殖能力和迁移活性减弱，但对细胞凋亡无影响。

慢病毒介导的HTRA1基因稳定过表达人脑血管平滑肌细胞株的建立

目的:构建并包装针对HTRA1基因以及其1091T>C突变基因(HTRA1-Mut)的过表达慢病毒载体,以及建立稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)株。方法:采用RT-PCR方法扩增HTRA1及HTRA1-Mut基因片段并将其连接于GV287载体质粒,采用慢病毒包装三质粒系统(GV287/p Helper 1.0/p Helper 2.0)转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液并标定病毒滴度,慢病毒感染经培养和鉴定的HBVSMC细胞株。结果:成功构建含HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒重组载体,PCR鉴定阳性的克隆进行测序和BLAST比对分析显示与源基因序列一致,并能够有效的感染并在293T细胞中表达。表达载体包装后测定病毒滴度为:2E+8 TU/mL。过表达慢病毒感染后HBVSMC有荧光表达,并且荧光率达80%以上,细胞生长良好传后细胞几乎无死亡现象。结论:成功构建了过表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的慢病毒表达载体,得到了较高滴度的病毒悬液,建成了稳定表达HTRA1及HTRA1-Mut基因的HBVSMC细胞株,为进一步探讨HTRA1基因及突变后细胞的功能变化提供了良好的研究工具。

曲美他嗪对人脑血管平滑肌细胞增殖、迁移及活性氧表达的影响及其机制

目的探讨曲美他嗪(TMZ)对人脑血管平滑肌细胞(HBVSMCs)增殖、迁移及活性氧(ROS)表达的影响及其机制。方法选用生长状况良好的对数生长期HBVSMCs分两部分进行实验,A实验:将HBVSMCs分为5组,对照组:不处理;血小板衍生生长因子(PDGF)组:加入10 ng/ml PDGF;0.2μmol/L、1.0μmol/L和5.0μmol/L TMZ组:在给予PDGF基础上,分别加入终浓度为0.2μmol/L、1.0μmol/L和5.0μmol/L TMZ。B实验:将HBVSMCs分为5组,对照组:不处理;PDGF组:给予10 ng/ml PDGF;TMZ组:在给予PDGF基础上,加入浓度为5.0μmol/L TMZ;XAV939组:在给予PDGF基础上,加入浓度为2.0μmol/L XAV939;TMZ+XAV939组:在给予PDGF基础上,加入5.0μmol/L TMZ和2.0μmol/L XAV939共同处理。采用噻唑蓝法、划痕实验、二氯荧光素法分别检测各组HBVSMCs的增殖活力、迁移率及ROS表达水平,采用蛋白质免疫印迹法检测HBVSMCs中Wnt/β-连环蛋白(catenin)信号通路相关蛋白β-catenin、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)-9及原癌基因蛋白质(c-Myc)的表达水平。结果A实验中,对照组、PDGF组、0.2μmol/L TMZ组、1.0μmol/L TMZ组、5.0μmol/L TMZ组HBVSMCs的OD值、迁移率、ROS、β-catenin、Cyclin D1、MMP-9及c-Myc表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中PDGF组上述指标均高于对照组,各浓度TMZ组上述指标均低于PDGF组,且呈浓度依赖性降低(P<0.05)。B实验中,对照组、PDGF组、TMZ组、XAV939组、TMZ+XAV939组HBVSMCs的OD值、迁移率及ROS表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05),其中PDGF组上述指标均高于对照组;TMZ组和XAV939组上述指标均低于PDGF组;TMZ+XAV939组上述指标均低于TMZ组(P<0.05)。结论TMZ可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活化抑制HBVSMCs增殖、迁移及ROS表达。

皮层下动脉硬化性脑病的临床及脑血管病理特点

脑血管疾病和认知功能障碍是最常见和最重要的老年期疾病,传统上认为两者是不同的状况(病因、病理、发病机制上),对两者常进行鉴别诊断并给予不同的处置。然而,近20年的大型流行病学研究、危险因素分析、大样本长期纵向随访研究和神经影像学的研究证据则强烈地提示两者间的相关性远远超过两者间的不同,它们有着很多共同的危险因素、病理上相互重叠、发病机制上相互作用、临床表现和影像发现上难以区分、治疗也大同小异。因此,对于通过认识Alzheimer病才了解认知功能障碍的绝大多数医师,迫切需要对血管性认知功能损害(VCI)有更新的了解并积极在临床实践中深化认识。掌握对VCI的评估工具、亚组分型,了解最常见的皮质下小血管病型的病理机制、危险因素和临床表现,都是临床应用所必需的。针对众说纷纭的治疗问题,理清思路、明确标准则是当务之急。

integrinβ3通过Src/ClC-3Cl-通道信号通路参与脑血管重构

脑血管重构是中风重要的危险因素之一,但发生机制不清楚.近期研究显示integrinβ3及ClC-3均参与血管增殖反应.本研究采用斑片钳单通道记录,结合分子生物学及免疫组化等技术在高血压脑血管重构的动物模型上,探讨integrinβ3与脑血管重构及其相关信号通路.研究发现,在自发性高血压大鼠,及双肾双夹高血压大鼠,以及血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）引起的高血压小鼠上,integrinβ3的表达与脑血管重构呈良好正相关,敲除integrinβ3可抑制AngⅡ引起的脑血管平滑肌细胞的增殖,integrinβ3与Src及ClC-3有相互作用.integrinβ3能作用于ClC-3磷酸化的关键位点,286位酪氨酸磷酸化从而介导ClC-3的活性,ClC-3敲除可阻止integrinβ3的增殖作用及AngⅡ引起脑血管重构.研究结果表明,integrinβ3是通过Src/ClC-3信号通路参与脑血管重构.

银可络并用尼莫地平治疗血管性头痛

血管性头痛是神经内科常见病,约占老年性头痛50％以上,其发病机制不十分清楚,可能为血液粘稠、动脉硬化、血管紧张度改变及钙超载有关。我们用银可络加尼莫地平治疗血管性头痛83例,取得了满意的临床效果。

葛根素注射液的临床不良反应分析

葛根素注射液是由从豆科植物野葛及甘葛藤的干燥根中提取的有效成分而制成的注射液。自1993年批准上市以来，已在临床上广泛应用，具有舒张冠脉及脑血管平滑肌，降低心肌耗氧量，改善心肌收缩能及微循环作用。临床上主要用于治疗冠心病，心绞痛、脑梗死等疾病。葛根素注射液最常见的不良反应是药物热、疹、溶血反应、休克，最严重的不良反应为溶血反应和休克，使用时应格外关注。本文就近年文献报道的不良反应综述如下，以供临床医生参考，引起重视。