羊传染性脓疱病毒口唇和内脏感染株趋化因子结合蛋白基因差异分析及原核表达

[目的]克隆羊传染性脓疱病毒(ORFV)口唇和内脏感染株趋化因子结合蛋白(CBP)基因并进行生物信息学分析及原核表达,为后续研究CBP基因在ORFV免疫逃逸机制中的作用提供基础数据。[方法]以患病羔羊口唇结痂和小肠提取的DNA为模板设计特异性引物,进行PCR扩增并克隆测序,对表达的CBP基因遗传进化关系及蛋白理化性质、结构特点进行分析;利用原核表达系统pGEX-4T-1构建重组质粒pGEX-4T-1-CBP-K、pGEX-4T-1-CBP-N并转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,并通过Western blotting对蛋白进行抗原性分析。[结果]经测序,ORFV口唇感染株CBP基因全长873 bp,内脏感染株CBP基因全长846 bp,且后者在第217 bp处有24 bp碱基的丢失。系统进化树显示,口唇与内脏感染株不属于同一进化分支,遗传距离较远;口唇感染株CBP基因与中国吉林分离株亲缘关系最近;内脏感染株CBP基因与马来西亚分离株亲缘关系最近。口唇感染株CBP基因编码291个氨基酸,内脏感染株CBP基因编码282个氨基酸,蛋白二级结构均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,三级结构有5处差异,主要是α-螺旋和β-折叠的变化。试验成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-CBP-K和pGEX-4T-1-CBP-N,其在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中以包涵体形式表达CBP融合蛋白,分子质量约为60 ku。[结论]本研究内脏感染株与口唇感染株相比,存在24 bp的缺失,并成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-CBP-K和pGEX-4T-1-CBP-N,可在大肠杆菌中表达CBP融合蛋白。本研究结果为揭示CBP在ORFV与宿主互作中发挥的作用提供参考,也可为寻找新的羊传染性脓疱防治方法提供依据。

羊传染性脓疱病毒和支原体混合感染的诊治

羊传染性脓疱病毒和支原体是两种常见的羊病原体,它们可以单独引起疾病,也可混合感染,导致更为复杂和严重的临床症状。本文综述了羊传染性脓疱病毒和支原体混感的诊治要点,包括病原学、流行病学、临床表现、诊断方法、治疗措施以及预防控制策略。

羊传染性脓疱病毒的诊断与防治

羊传染性脓疱病毒病俗称“羊口疮”,是由羊传染性脓疱病毒感染引起的一种急性、高度接触性的传染病。该病在世界范围内广泛存在,感染性强、传播迅速,羊群一旦感染很难彻底清除,给世界养羊业带来了巨大的经济损失,并且威胁人类健康,受到越来越多人的关注。截至目前,对于该病尚未发现特效治疗方法和特效药物,疫苗免疫是预防羊传染性脓疱病毒病的关键。本文结合最近几年羊传染性脓疱病毒病的流行特点对该病进行了总结分析,以期能为广大同行提供参考。

羊传染性脓疱病毒和支原体混感的诊治

某绵羊场发生了一起病例,我站通过临床诊断、病理剖检、常规RT-PCR和实时荧光定量PCR的检测方法对其进行了检测,检测结果为羊传染性脓疱病毒阳性,且R T-PCR扩增得到750bp的条带,说明该羊场为羊传染性脓疱病毒和支原体混合感染。对全场环境和工具进行消毒,对发病羊及时进行隔离治疗,预后良好。

羊传染性脓疱病毒湖北株的鉴定及分子特征分析

为了确诊疑似羊传染性脓疱病例,分析羊传染性脓疱病毒(Orfvirus,ORFV)的分子特征,作者以湖北某羊场疑似传染性脓疱病料为对象,进行了电镜观察、病理切片染色、特异性目的基因扩增和序列测定及遗传进化关系分析。结果在电镜下观察到ORFV样粒子,切片HE染色可见有炎性细胞浸润,自病料中扩增出特异性目的ORFVB2L基因片段(GenBank序列号GU320351)。结果表明该病例为黑山羊传染性脓疱病毒引起,序列遗传进化分析表明该病毒和2007年分离于中国台湾的毒株(DQ904351)遗传关系最近,和印度2004到2005年分离于绵羊(DQ263306、DQ263305)、山羊(DQ263304、DQ263303)的ORFV同属于一个进化分支。本研究为ORFV分子流行病学研究积累了资料。

羊传染性脓疱病毒基因组结构和主要基因功能研究进展

羊传染性脓疱(羊口疮)是由羊传染性脓疱病毒(羊口疮病毒,ORFV)引起的一种重要人兽共患传染病,ORFV作为副痘病毒属的代表成员之一,其基因组结构和功能具有明显的种属特异性。ORFV基因组是由中央核心区和两端反向末端重复序列构成,中央核心区主要调控病毒的复制、组装和释放,两端重复序列则决定ORFV的毒力、宿主范围、参与免疫逃避及免疫调节。论文综述了ORFV的基因组结构及功能最新研究进展。

羊传染性脓疱病毒的分离鉴定

为了对羊传染性脓疱病毒的分离株ORF027基因、ORF059部分基因进行克隆、序列分析以及构建系统进化树,本研究应用犊牛睾丸细胞从病羊痂皮病料中分离获得了1株羊传染性脓疱病毒,命名为Orf-ys,在电镜下观察到了典型的病毒粒子。应用PCR方法扩增获得了2条基因片段,PCR产物克隆至pMD18-T载体,鉴定后测序。序列分析结果表明Orf-ys的2个基因分别与参考毒株的相关基因核苷酸同源性高达97.6%～98.6%和96.9%～98.4%。基因进化树比较显示,与美国OV-IA82株和意大利OV/C2、OV/mi-90株的进化关系最近。

羊传染性脓疱病毒ORF047基因表达及其蛋白在细胞中的定位分析

目的克隆羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)ORF047基因,并进行真核表达及亚细胞定位,为筛选与其相互作用的蛋白提供依据。方法提取羊传染性脓疱病毒分离株的DNA,以其为模板,参照OV-SA00毒株(NC-005336.1)基因ORF047序列,采用PCR技术扩增ORFV ORF047基因片段,凝胶回收后将其插入pEGFP-N1载体,构建重组质粒pEGFPORF047,测序后重组质粒共转染293T细胞,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。后将重组质粒pEGFP-ORF047与pHcRed1-Nuc、pHCRed1-mito、pHcRed1-ER分别共转染Vero-E6细胞,通过激光共聚焦显微镜对融合蛋白进行亚细胞定位分析。结果 ORFV ORF047基因片段大小为735bp;重组质粒pEGFP-ORF047能够在293T细胞中明显表达融合有目的分子的绿色荧光蛋白,Western blotting检测表达的融合蛋白大小约54kD;亚细胞定位分析表明,ORF047蛋白主要定位于胞浆中,少量在线粒体中。结论成功分析了ORF047基因的表达与其蛋白在亚细胞定位。

羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因的克隆与序列分析

本试验通过对羊传染性脓疱病毒内蒙分离株(OV/nm-05)进行总DNA提取,参考GeneBank中OrfVirus(Strain NZ2)株F1L基因序列设计一对引物,应用PCR技术特异性地扩增出该毒株的F1L基因的片段,并将其克隆到pGEM-Teasy载体后进行测序,得到该病毒F1L基因序列。应用计算机软件将测定序列与参考毒株OV/7、Strain NZ2、OV/C2、OV/mi-90、OV/Torino、OV/2的F1L基因序列进行比较。结果表明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株与Strain NZ2同原性最高,达99.1%,与OV/Torino最低,但也为96.3%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因与其他参考毒株之间差异不大。

羊传染性脓疱病毒NZ2毒株CBP蛋白结构分析与表位预测

本研究应用生物信息学方法,以ORFV NZ2毒株的CBP蛋白氨基酸序列为研究对象,对CBP蛋白的理化特性、亲水性、跨膜区、信号肽、二级结构、三级结构、B细胞表位和T细胞表位进行了预测分析。结果显示,CBP蛋白的相对分子质量为31.17989 kDa,理论等电点为4.68,半衰期为30 h,稳定系数为43.06,脂肪族指数为81.78,总平均亲水性为-0.383。CBP蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不属于跨膜蛋白,存在信号肽;二级结构中α螺旋、β折叠、β转角、无规卷曲分别占38.11%、33.91%、5.94%和10.48%,三级结构形似倒立的哑铃,上下对称。筛选出了6个优势B细胞表位、3个CTL细胞表位,无Th细胞表位。CBP蛋白为亲水性膜外蛋白,细胞表位较少,在细胞膜外为ORFV逃避宿主免疫反应发挥作用。本研究为CBP蛋白的功能研究与ORFV的致病机制研究提供了理论依据。

羊传染性脓疱病毒抗干扰素基因(VIR)研究进展

羊传染性脓疱病毒（ORFV）是痘病毒科副痘病毒属的成员之一,引起严重的人兽共患传染病。该病毒基因组全长约134~139kb,编码130多个蛋白,抗干扰素基因是ORFV编码的具有拮抗宿主干扰素功能的蛋白,在ORFV突破宿主免疫屏障过程中有重要作用。本文就抗干扰素基因的研究进展作一综述。

羊传染性脓疱病毒分离及生物学特性研究

用犊牛睾丸细胞及BK细胞,从我国内蒙古自治区达拉特旗发病的进口小尾寒羊痂块中分离到1株病毒,对其进行连续传代至病变稳定。通过对该分离株进行动物回归试验,在犊牛睾丸细胞及BK细胞中的增殖特性试验、病毒核酸类型鉴定试验、脂溶剂敏感试验及其它生物学特性试验、电镜观察等,初步鉴定该分离株为羊传染性脓疱病毒。

羊传染性脓疱病毒吉林分离株F1L基因的克隆与同源性分析

通过参考GenBank中羊传染性脓疱病毒的F1L基因序列设计引物,应用PCR技术的特异性扩增了羊传染性脓疱病毒JLSY04株的F1L基因片段,测序得到了该病毒F1L基因序列,并与几个参考毒株序列进行比对.实验结果表明,羊传染性脓疱病毒JLSY04株与OV/Torino株同源性最低,为96.0%,与Jilin株同源性最高,为99.4%.即该羊传染性脓疱病毒JLSY04株F1L基因与其他参考毒株间的差异较小,可作为基因工程疫苗的目的基因.

羊传染性脓疱病毒血管内皮生长因子功能研究进展

羊传染性脓疱是由副痘病毒属的羊传染性脓疱病毒(orfv)引起的一种重要的人兽共患性传染病,orfv血管内皮生长因子(VEGF)是其重要的毒力基因之一。VEGF具有促进宿主表皮细胞增生、引起血管内皮细胞增殖和毛细血管通透性增加等功能。本文从orfv编码VEGF的抗宿主免疫活性、结构、受体和配体相互作用、结合肝素和神经粘蛋白活性等方面进行了综述,以期全面阐明orfv编码的VEGF功能。

羊传染性脓疱病毒分离及生物学特性研究

用犊牛睾丸细胞及BK细胞,从内蒙古自治区达拉特旗发病的进口小尾寒羊痂块中分离到一株病毒,对其进行连续传代至病变稳定。通过对该分离株进行动物回归试验,在犊牛睾丸细胞及BK细胞中的增殖特性试验、病毒核酸类型鉴定试验、脂溶剂敏感试验及其它生物学特性试验、电镜观察等,初步鉴定该分离株为羊传染性脓疱病毒。

西藏尼玛县羊传染性脓疱病毒B2L和F1L基因的遗传进化分析

为研究西藏尼玛县羊传染性脓疱病毒遗传进化现状,采集了西藏尼玛县内某养殖户中疑似患羊传染性脓疱的患羊唇部分泌物,采用病毒分离、PCR、基因克隆、测序等技术,将分离株的B2L、F1L和ORF020基因与GenBank公布的部分流行株相应序列进行对比分析。结果显示,B2L基因在核苷酸水平显示96.4%~98%的同源性,与吉林分离株(MG712417)的同源性最高,为98%,与广东分离株(KY053526)的亲缘关系最近,同源性为97.9%;F1L基因在核苷酸水平显示95.3%~97.5%的同源性,与陕西分离株(KJ139957)的亲缘关系最近,同源性为97.5%;ORF020基因在核苷酸水平显示95.1%~99.5%的同源性,与陕西分离株(KJ139958)亲缘关系最近,同源性为99.5%。基于B2L、F1L、ORF020遗传进化分析表明,CPDV在不同地理环境和宿主中存在基因差异,但总体表现出保守性,同时表明西藏尼玛县境内CPDV流行的复杂性,研究结果可为该地区CPDV防控等相关研究提供参考。

羊传染性脓疱病毒OVIFNR蛋白结构分析与B细胞表位预测

本研究应用生物信息学方法,预测分析羊传染性脓疱病毒(ORFV)的OVIFNR蛋白结构与B细胞抗原表位。从羊传染性脓疱病羊嘴唇结痂中扩增出ORFV的OVIFNR基因序列并进行测序鉴定,上传至NCBI;应用生物信息学软件,将扩增所得的OVIFNR基因序列和GenBank公布的参考序列,在核苷酸和氨基酸水平上进行同源性分析和遗传进化树构建,并对OVIFNR蛋白分子的理化特性、跨膜区、信号肽、亲疏水性、二级结构、三级结构和B细胞抗原表位进行预测分析。结果显示:所扩增序列与Hoping和Nantou毒株的OVIFNR基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为99.6%和100%;通过遗传进化树发现,所扩增序列的毒株与Hoping、ShanX、Nantou毒株处于同一分支;OVIFNR蛋白的理论等电点为4.83,半衰期为30h,脂肪族指数77.92,总平均疏水性为–0.181,无跨膜区和信号肽,不属于跨膜蛋白;二级结构中α螺旋、β折叠、β转角、无规卷曲分别占68.64%、7.56%、15.13%、9.18%,筛选出了8个优势B细胞表位;OVIFNR蛋白为亲水性蛋白,含有较多B细胞表位,具有抗原性,可以作为ORFV检测的新靶点。本研究为OVIFNR蛋白的功能研究和ORFV检测方法的建立提供了理论依据。

羊传染性脓疱病毒B2L基因片段重组腺病毒载体的构建

[目的]利用腺病毒载体系统构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组腺病毒载体。[方法]以从羊传染性脓疱病毒株JLSY04中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增获得B2L目的基因片段;然后将B2L目的基因克隆至PDNR-CMV载体,筛选阳性克隆获得质粒CTC572-6;再将质粒CTC572-6与腺病毒载体进行同源重组,筛选阳性克隆,并进行菌液PCR、酶切、测序等鉴定。[结果]经酶切和基因测序等鉴定,成功构建了携带羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组腺病毒载体CTC572Ade-30。[结论]为羊传染性脓疱基因工程疫苗的进一步研究奠定基础。

羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株B2L基因的克隆与序列分析

提取羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株(OV/nm-05)总DNA,参考GeneBank中OrfVirus(StrainNZ2)株B2L基因序列设计1对引物,应用PCR技术特异性地扩增出该毒株的B2L基因的片段,并将其克隆到pMD18-T载体后进行测序,得到该病毒B2L基因序列。应用计算机软件将测定序列与参考毒株OV-SAOO、StrainNZ2、OV-IA82、N86.20a、N94.10m、No03.8Rt的B2L基因序列进行比较。结果表明,羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株与StrainNZ2同源性最高,达97.9%,与N86.20a同源性最低,为84.2%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株B2L基因与其他参考毒株之间差异不大。

酶联免疫吸附试验检测羊传染性脓疱病毒

用辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记经兔体高免提纯的兔抗羊传染性脓疱病（Ｏｒｆ）ＩｇＧ，用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测不同毒株的传染性脓疱病毒及病毒基因在载体中重组克隆后转化到受体菌中的表达情况。结果表明，ＨＲＰ标记的ＩｇＧ，经自动酶标光度计检测，对ＨＣＥ、ＨＬＲ、ＬＭＥ、ＤＰＥ、ＨＢＧＥ、ＹＬＧＥ毒、ＬＴＥ囊膜蛋白及ＨＣＥ１０代细胞毒都呈现特异性反应。在模式２的检测中，ＯＤ值均在０．０７以上，在模式３的检测中，都呈现阳性。受检的４株重组转化大肠杆菌中，一株表现阳性，说明重组菌对Ｏｒｆ病毒的抗原产生表达。试验证明，ＥＬＩＳＡ是对羊传染性脓疱病毒进行诊断检测的一种快速、灵敏、准确的方法。