人脯氨肽酶活性中心结构的计算机模拟

氨酰基脯氨酸二肽酶 (脯氨肽酶 )为广泛分布于生物界的细胞内二肽水解酶 .它特异性地水解以脯氨酸或羟脯氨酸为羧基端的二肽 (X Pro) ,而且只对反式肽键有催化活性 .此酶与脯氨酸代谢、胶原蛋白合成及细胞生长有密切关系 .文献报道 ,从Alteromonas细菌中提取的脯氨肽酶有水解梭曼的活性 ,其有机磷酸酐水解酶也有脯氨肽酶活性 .用重组基因表达的人肝脯氨肽酶也同时具有脯氨肽酶活性和水解梭曼的活性 .研究脯氨肽酶活性中心的结构具有重要理论意义和潜在实用价值 .但目前尚无人脯氨肽酶晶体结构的报道 .本文采用蛋白质结构模式识别 (threading)方法对脯氨肽酶的高级结构进行模拟 ,以大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶 (1MAT)为模板 ,模建了人脯氨肽酶C端结构域的空间结构 .通过对模建结构的 3D评估及电荷分布分析 ,对人脯氨肽酶活力中心结构进行了预测 .模建的人脯氨肽酶活性中心位于C端结构域 ,为 6条β折叠围成的一个疏水性口袋 ,外面被 5条α螺旋及一些loop包围 ,活力中心位于疏水结构中央 ,其中有 5个保守氨基酸 ,形成 1个较强的负电荷区 ,周围有 3个较弱的正电荷区域 .实验还发现 ,虽然Mn2 + 或Co2 + 对酶的活性极其重要 ,但对酶蛋白结构的贡献很小 .

结核性胸腔积液患者血清及胸腔积液中脯氨肽酶活性分析

目的了解结核性与非结核性胸腔积液患者的血清及胸腔积液中脯氨肽酶(PLD)活性的差异,分析PLD对结核性胸腔积液的诊断意义。方法用ELISA法测定26例结核性胸腔积液患者(观察组)和28例非结核性胸腔积液患者(对照组)血清及胸腔积液中PLD水平,应用t检验统计分析结果。结果观察组血清及胸腔积液PLD活性水平高于对照组(P<0.05)。结论 PLD活性检测对鉴别结核性胸膜炎和其他疾病所致胸腔积液有重要意义。

原发性肝癌患者血清和癌组织中脯氨肽酶测定的临床意义

测定了１５４例原发性肝癌、肝硬化、慢性肝炎、肝良性占位和健康人血清脯氨肽酶活力以及１６例病理证实的肝细胞癌组织中脯氨肽酶比活力。结果发现：原发性肝癌（４５例）血清脯氨肽酶活力显著地高于肝硬化（３０例）、慢性肝炎（２２例）、良性肝占位（２５例）和健康人（３２例）（Ｐ＜０．０１）。肝细胞癌组织中脯氨肽酶比活力高于非癌肝组织（Ｐ＜０．０１）。本文结果表明：血清中脯氨肽酶可作为慢性肝病癌变的血清学辅助诊断指标之一。并有利于肝脏占位性病变的鉴别。

脯氨酰内肽酶水解不同来源畜禽骨胶原蛋白的特性分析

为探究脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP)在骨胶原蛋白肽酶法制备过程中的应用潜力,分别以牛骨胶原蛋白(bovine bone collagen,BBC)、猪骨胶原蛋白(porcine bone collagen,PBC)、鸡骨胶原蛋白(chicken bone collagen,CBC)为原料,对比分析3种不同来源骨胶原蛋白的序列特征,预测不同骨胶原蛋白潜在的酶解作用位点和理论水解度。在55℃、pH 8.0条件下,利用PEP水解处理3种不同来源骨胶原蛋白,通过水解度、分子质量分布测定和扫描电子显微镜观察等方法进行表征。利用红外光谱、X射线衍射和圆二色光谱等方法探究酶解过程中胶原蛋白结构变化。结果表明,PEP对3种不同来源骨胶原蛋白均有显著水解效果,PBC的水解度最高,为51.35%,其次分别为CBC(29.81%)和BBC(22.81%)。3种骨胶原蛋白酶解产物分子质量多分布在500 Da以下。光谱学分析表明PEP破坏了胶原蛋白的三螺旋结构,从而使胶原蛋白降解,达到制备胶原蛋白肽的效果。PEP可以高效酶解骨胶原蛋白制备小分子蛋白肽,本研究可为功能性骨胶原蛋白肽的酶法制备提供依据。

脯氨肽酶的生化性质

综述了脯氨肽酶 (prolidase)的生化性质 ,详细论述了人脯氨肽酶的生理、理化性质、序列及其空间结构 ,并对动物组织与微生物中存在的脯氨肽酶性质进行了比较。

血清透明质酸Ⅲ型前胶原Ⅳ型胶原及脯氨酸肽酶对肝组织纤维化诊断的意义

探讨肝病患者血清透明质酸(HA),Ⅲ型前胶原(PCⅢ),Ⅳ型胶原(CⅣ)及脯氨酸肽酶(PLD)水平与肝纤维化程度的关系。用酶联免疫(ELISA)法及生化比色法检测225例各种肝病患者血清中HA、PCⅢ、CⅣ及PLD水平,并与肝活检病理炎症分级和纤维化分期相比较。四项指标与肝组织炎症坏死及纤维化程度均呈显著相关(P<0.05)。HA、PCⅢ及CⅣ与肝纤维化相关性高于炎症,PLD与炎症的相关性高于纤维化。血清学指标与肝组织病理病变程度一致,联合检测肝病患者血清HA、PCⅢ、CⅣ及PLD水平,既可反映肝纤维化严重程度,又能了解肝坏死情况,为临床诊断治疗提供参考。

快速脯氨酸氨基肽酶检测在细菌性阴道病诊断中的应用价值

目的 运用PIPTestCard技术检测阴道分泌物中脯氨酸氨基肽酶 (PIP)的活性 ,并观察其在细菌性阴道病 (BV)诊断中的价值。方法 以无菌棉拭子采集患者阴道分泌物 ,分别作PIP活性检测及传统的Amsel临床诊断标准的判断。结果 PIPTestCard在诊断BV中与Amsel临床诊断标准的符合率为 92 .88% ,其敏感性和特异性分别达到 91.75 %及 94 .4 8% ,阳性预测值为 95 .94 %。结论 PIP活性检测是诊断BV的一种较为可靠的方法 ,与传统方法相比PIPTestCard更快速、简便 ,易于床边检测。

肝病患者血清脯氨酸肽酶活性检测的临床应用

目的研究血清脯氨酸肽酶活性在肝病中的应用价值。方法采用酶促反应终点法检测了50例健康人和137例肝病患者血清脯氨酸肽酶活性。结果脯氨酸肽酶的正常参考范围为(854.64±191.79)U/L,肝病各组脯氨酸肽酶水平显著高于正常对照组(P<0.01);经过治疗后各组肝病患者脯氨酸肽酶水平均比治疗前降低(P<0.01);当脯氨酸肽酶水平持续高于2 500 U/L时,肝硬化患者存活率为28.57%,而当脯氨酸肽酶水平稳定在1 800U/L以下时,存活率为94.12%(P<0.01)。结论血清脯氨酸肽酶活性的检测可估测肝病患者的病情、评价疗效和判断肝硬化患者的预后。

肺纤维化患者血清Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原及脯氨酸肽酶含量的改变

目的 探讨肺纤维化患者血清Ⅲ型前胶原 (PCⅢ )、Ⅳ型胶原 (CⅣ )及脯氨酸肽酶 (PLD)的含量变化及临床意义。方法 对 2 5例肺纤维化患者和 2 0例健康人采用放射免疫分析法检测血清中PCⅢ及CⅣ的含量 ;用比色法检测血清中PLD含量。结果 肺纤维化患者血清中PCⅢ及CⅣ含量明显增高 ,同时PLD含量亦增加 ,与健康对照组比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ,且三者之间呈明显正相关 (P <0 .0 5或 <0 .0 1)。结论 肺纤维化患者血清PCⅢ、CⅣ及PLD的水平可作为反映肺纤维化改变的参考指标。

硅胶、脯氨酰内肽酶处理对啤酒非生物稳定性的影响

采用SDS-PAGE电泳,对分别经硅胶吸附和脯氨酰内肽酶水解的啤酒后酵液进行蛋白分布研究;通过测定浊度和泡持性研究二者对啤酒非生物稳定性的影响。结果表明经硅胶吸附和脯氨酰内肽酶水解后的蛋白分子量均集中在8ku-14.4ku和35ku-45ku;经处理后的样品浊度明显下降,而泡持性没有显著变化。其中用脯氨酰内肽酶处理时浊度下降更明显,且对啤酒的泡持性影响更小。因此,在啤酒后酵液中添加脯氨酰内肽酶,能够有效的除去啤酒冷混浊蛋白,提高啤酒的非生物稳定性。

血清脯氨酸肽酶活性的微量法测定

介绍了以极微量血清测定血清脯氨酸肽酶（PLD）活性方法，并探索了测定PLD活性最佳条件，测定方法简单、快速，适合于一般医院临床检测．

黑曲霉W3350脯氨酰内肽酶在大肠杆菌中的表达

目的:构建pET-PEP重组原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法:采用RT-PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)W3350中扩增出脯氨酰内肽酶(PEP)的基因,插入表达载体pET-22b(+),经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切和DNA序列测定验证,将正确的重组质粒转入大肠杆茵BL21(DE3)中,IPTG(终浓度1mmol/L)诱导获得表达。结果:表达产物进行超声破碎,经SDS-PAGE电泳检测,PEP分子质量大约为57kDa,与理论值相符,通过酶活方法测定脯氨酰内肽酶酶活为0.656U/ml,约是出发菌株的5倍。结论:首次成功构建表达载体pET-PEP并在原核细胞中表达,为进一步研究PEP的生物学功能奠定了基础。

联合检测血清层粘蛋白、透明质酸及脯氨酸肽酶对肝硬化早期的评估

目的 通过检测血清层粘蛋白 (LN)、透明质酸 (HA)及脯氨酸肽酶 (PLD)评价其在肝硬化早期防治的临床价值。方法 用酶联免疫法检测 2 66例肝病患者。 (其中急性肝炎 46例 ,慢性肝炎 13 6例 ,肝硬化 84例 )血清层粘蛋白、透明质酸及脯氨酸肽酶 ,并将三者进行比例分析。结果 与正常血清比较 ,急性肝炎患者其血清中LN、HA、PLD的含量无明显的正相关 (P >0 .0 5 ) ;慢性肝炎患者其血清中LN、HA、PLD的含量呈明显的正相关 (P <0 .0 5 ) ;肝硬化患者其血清中LN、HA、PLD的含量呈极显著的正相关 (P <0 .0 1)。结论 检测血清层粘蛋白、透明质酸及脯氨酸肽酶对肝硬化早期的防治具有重要的临床意义。

脯氨酰内肽酶研究进展

脯氨酰内肽酶 (prolylendopeptidase ,PEP) [EC3 4 2 1 2 6 ]是一种能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶 ,能降解许多多肽类神经递质和激素 ,其活性的异常会引起精神、认知过程的障碍 .一些PEP的专一性抑制剂 (如JTP 4819)显示在莨菪胺引起的小鼠记忆障碍模型中有改善记忆的药理作用 .猪肌肉PEP晶体结构的解析推动了PEP的研究 .

黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶基因的克隆及其在酵母中的表达

以A.niger TCCC41013总RNA为模板,通过RT-PCR扩增含自身信号肽的脯氨酸蛋白内肽酶基因pep,将其克隆到pUCm-T载体上进行测序。测序结果表明基因全长1581bp,共编码526个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽序列和504个氨基酸的成熟肽序列。通过生物信息学方法对蛋白质的理化性质进行分析预测,脯氨酸蛋白内肽酶等电点为4.43,具有丝氨酸活性中心,属丝氨酸羧肽酶S28家族。以重组质粒pUCm-T-pep为模板,通过PCR扩增去除自身信号肽的pep,构建毕赤酵母表达栽体pPIC9-pep,电转酵母宿主菌GS115。SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量为60000Da左右,酶特异性底物法测定酶活力最高可达2275.4 mU/mL。