脯氨酰内肽酶水解不同来源畜禽骨胶原蛋白的特性分析

为探究脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP)在骨胶原蛋白肽酶法制备过程中的应用潜力,分别以牛骨胶原蛋白(bovine bone collagen,BBC)、猪骨胶原蛋白(porcine bone collagen,PBC)、鸡骨胶原蛋白(chicken bone collagen,CBC)为原料,对比分析3种不同来源骨胶原蛋白的序列特征,预测不同骨胶原蛋白潜在的酶解作用位点和理论水解度。在55℃、pH 8.0条件下,利用PEP水解处理3种不同来源骨胶原蛋白,通过水解度、分子质量分布测定和扫描电子显微镜观察等方法进行表征。利用红外光谱、X射线衍射和圆二色光谱等方法探究酶解过程中胶原蛋白结构变化。结果表明,PEP对3种不同来源骨胶原蛋白均有显著水解效果,PBC的水解度最高,为51.35%,其次分别为CBC(29.81%)和BBC(22.81%)。3种骨胶原蛋白酶解产物分子质量多分布在500 Da以下。光谱学分析表明PEP破坏了胶原蛋白的三螺旋结构,从而使胶原蛋白降解,达到制备胶原蛋白肽的效果。PEP可以高效酶解骨胶原蛋白制备小分子蛋白肽,本研究可为功能性骨胶原蛋白肽的酶法制备提供依据。

硅胶、脯氨酰内肽酶处理对啤酒非生物稳定性的影响

采用SDS-PAGE电泳,对分别经硅胶吸附和脯氨酰内肽酶水解的啤酒后酵液进行蛋白分布研究;通过测定浊度和泡持性研究二者对啤酒非生物稳定性的影响。结果表明经硅胶吸附和脯氨酰内肽酶水解后的蛋白分子量均集中在8ku-14.4ku和35ku-45ku;经处理后的样品浊度明显下降,而泡持性没有显著变化。其中用脯氨酰内肽酶处理时浊度下降更明显,且对啤酒的泡持性影响更小。因此,在啤酒后酵液中添加脯氨酰内肽酶,能够有效的除去啤酒冷混浊蛋白,提高啤酒的非生物稳定性。

脯氨酰内肽酶研究进展

脯氨酰内肽酶 (prolylendopeptidase ,PEP) [EC3 4 2 1 2 6 ]是一种能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶 ,能降解许多多肽类神经递质和激素 ,其活性的异常会引起精神、认知过程的障碍 .一些PEP的专一性抑制剂 (如JTP 4819)显示在莨菪胺引起的小鼠记忆障碍模型中有改善记忆的药理作用 .猪肌肉PEP晶体结构的解析推动了PEP的研究 .

黑曲霉W3350脯氨酰内肽酶在大肠杆菌中的表达

目的:构建pET-PEP重组原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法:采用RT-PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)W3350中扩增出脯氨酰内肽酶(PEP)的基因,插入表达载体pET-22b(+),经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切和DNA序列测定验证,将正确的重组质粒转入大肠杆茵BL21(DE3)中,IPTG(终浓度1mmol/L)诱导获得表达。结果:表达产物进行超声破碎,经SDS-PAGE电泳检测,PEP分子质量大约为57kDa,与理论值相符,通过酶活方法测定脯氨酰内肽酶酶活为0.656U/ml,约是出发菌株的5倍。结论:首次成功构建表达载体pET-PEP并在原核细胞中表达,为进一步研究PEP的生物学功能奠定了基础。

脯氨酰内肽酶水解啤酒蛋白的研究

将脯氨酰内肽酶(PEP)添加在啤酒后酵液中,通过冷混浊实验分析脯氨酰内肽酶对啤酒非生物稳定性的影响。结果表明,添加5mg/L的脯氨酰内肽酶就能有效地提高啤酒的非生物稳定性;采用75%硫酸铵沉淀啤酒蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析,结果显示,啤酒蛋白电泳图谱的分布主要表现为8～14.4 ku的窄带和35～45 ku的宽带,而经脯氨酰内肽酶处理的啤酒蛋白电泳图谱中8～14.4 ku的条带消失,说明此蛋白被脯氨酰内肽酶水解。

脯氨酰内肽酶的固定化研究

以D380为载体进行脯氨酰内肽酶的固定化研究,确定了其最佳固定化条件为加酶量为140U/g,戊二醛浓度为0.3%,固定化温度为25℃,吸附14h,交联6h。固定化酶活达到89.5U/g,酶活回收率63.9%。固定化酶最适反应温度为40℃,最适反应pH值为5.5。

重组点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的纯化和鉴定

报道重组点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶 (简称apPEP)的基因工程下游工艺研究。工程菌株E .coliBL2 1/ pKKH PEP表达产物apPEP为可溶性蛋白 ,在NBSBioFlo 30 0 0型 5L自控发酵罐中经 14h培养每升发酵液可达到 2 2 5 g干重菌体 ,含apPEP 3 0g左右。发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后 ,依次经SephadexG 2 5、HighperformanceQsepharoseFF(HP Q)、Phenylseparose 6FF柱层析分离纯化 ,每升发酵产物最终可得 0 86 g纯度达96 %的重组apPEP ,比活力达到 6 5 5u/mg ,整个纯化工艺的蛋白回收率为 8 2 % ,活力回收率为 2 4 4%。纯化的apPEP经电喷雾质谱测定分子量为 76 46 4± 30D ,N端氨基酸序列与基因序列推导的一致。等电点为 pI6 0左右。与Aeromonashydrophila来源的PEP(pI =5 5 )相近。

高产高纯度脯氨酰内肽酶黑曲霉工程菌的构建

利用基因工程技术,构建过表达黑曲霉来源带有自身信号肽的脯氨酰内肽酶黑曲霉重组菌株TH2-protAS和过表达以黑曲霉内源高效分泌的葡糖淀粉酶信号肽以及α-淀粉酶信号肽代替自身信号肽的脯氨酰内肽酶黑曲霉重组菌株TH2-SglaA-protA和TH2-SamyA-protA。SDS-PAGE结果显示,脯氨酰内肽酶在重组菌株中分泌表达,但是存在不同程度的糖基化。酶活检测结果表明,重组菌株TH2-protAS、TH2-SglaA-protA和TH2-SamyA-protA的最高酶活分别为1.70、2.19、1.91 U/mL。在重组菌株TH2-SglaA-protA的基础上,利用基因敲除技术,敲除了主要的背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶,结合发酵条件优化,获得了高纯度的脯氨酰内肽酶。综合上述结果可得出结论:可在黑曲霉中同源高效分泌表达脯氨酰内肽酶;glaA信号肽和amyA信号肽明显增加黑曲霉中脯氨酰内肽酶的分泌表达量,且glaA信号肽的效果优于amyA信号肽;将基因敲除和发酵调控相结合,可以有效去除分泌的背景蛋白,获得高产高纯度脯氨酰内肽酶的菌株,该重组菌株具有明确的工业应用潜力。

非酒精性脂肪性肝病小鼠肝组织脯氨酰内肽酶蛋白及其活性变化

目的观察高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠肝脏脯氨酰内肽酶(PREP)蛋白水平及活性的变化。方法随机将40只雄性C57BL/6J小鼠分成普通饲料和高脂饲料喂养组,分别在喂养4 w和16 w处死小鼠。检测血生化指标,观察肝组织病理学变化并计算NAFLD活动度积分(NAS);采用荧光定量PCR法、Western blot法和Suc-Gly-Pro-AMC底物法分别检测肝组织PREP m RNA、蛋白水平和活性变化。结果在高脂饮食喂养4 w,模型组小鼠肝细胞出现轻度脂肪变,NAS积分为(3.43±0.79),较对照组显著升高;在高脂饮食喂养16w,模型组小鼠体质量、肝指数、ALT、甘油三脂、总胆固醇和空腹血糖分别为(32.93±2.72)g、(4.64±0.46)%、(53.64±22.01)IU/L、(1.18±0.17)mmol/L、(4.34±0.44)mmol/L和(5.67±0.87)mmol/L,显著高于对照组【分别为(28.19±1.23)g、(4.02±0.11)%、(28.60±4.01)IU/L、(0.99±0.15)mmol/L、(2.94±0.18)mmol/L和(4.26±0.65)mmol/L,P<0.05】;模型组肝组织NAS积分为(5.60±1.43),显著高于对照组【(0.40±0.70),P<0.01】;PREP蛋白水平与对照组相比无显著性差异,但PREP m RNA水平和酶活性分别为对照组的(1.81±0.34)倍(P<0.01)和(1.36±1.78)倍(P<0.05)。结论小鼠肝组织PREP活性变化可能参与了小鼠非酒精性单纯性脂肪肝向脂肪性肝炎的转变。

迷迭香酸抑制脯氨酰内肽酶功能对非酒精性脂肪性肝病的影响

目的探索迷迭香酸对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的影响及其可能机制。方法利用高脂饮食建立小鼠NAFLD模型,以迷迭香酸进行干预,观察全部小鼠体质量、肝指数、血清生化指标及肝组织脂肪变、炎症等变化情况,并探索其与脯氨酰内肽酶(PREP)之间的关系。结果干预组小鼠肝指数为(4.51±0.30)%、AST为65.82(53.00~72.50)U/L、ALP为(37.94±4.26)U/L,与模型组相比有显著性改善(P<0.05),干预组小鼠肝脏脂肪变性减轻,肝小叶形态和汇管区无结构性改变,但NAFLD活动度积分(NAS)与模型组相比,差异无统计学意义(P>0.05);模型组肝组织PREP mRNA RQ值为2.01±0.35,PREP蛋白活性为(470.10±50.86)pmol·mg^-1·min^-1,均较对照组升高(P<0.05);干预组肝组织PREP mRNA RQ值为1.21±0.22,PREP蛋白活性为(269.75±34.32)pmol·mg^-1·min^-1,相比于模型组显著降低(P<0.05),与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论迷迭香酸干预显著抑制肝内源性PREP活性,降低ALT水平,但未能抑制NAFLD进展。

利用坛紫菜藻红蛋白制备脯氨酰内肽酶抑制肽

以坛紫菜(Porphyra haitanensis)为原料,通过硫酸铵盐析和DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析等方法分离纯化得到一种高纯度藻红蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)(A565 nm/A280 nm=5.4)。利用胃、肠液消化酶对R-PE进行酶解制备脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP)抑制肽。酶解条件为:1)胃蛋白酶与R-PE比例0.5%(m/m),酶解时间30 min,pH 1.2,温度37℃;2)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶质量比为1∶1的混合酶,其与R-PE比例0.25%(m/m),酶解时间30 min,pH 7.5,温度37℃。Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析发现,经两步酶解,R-PE被完全降解。采用凝胶过滤色谱法测得R-PE水解液中分子质量在3 kDa以下的小肽含量为86.06%。R-PE水解液对PEP抑制水平IC50为136.35μg/mL。酶抑制动力学研究发现,R-PE水解液对PEP表现为可逆的非竞争性抑制作用,抑制常数Ki为14μg/mL。本研究利用坛紫菜R-PE制备活性高的PEP抑制肽,将为坛紫菜深加工及高值化利用提供一定的理论参考。

鲈鱼脯氨酰内肽酶的分离纯化、性质分析及分子克隆

采用(NH4)2SO4盐析和连续柱层析法从鲈鱼(Lateolabrax japonicus)骨骼肌中分离纯化了一种脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP)。通过液相色谱-串联质谱分析,得到43个与红鳍东方鲀的PEP高度一致的肽片段,证实该酶为PEP。以琥珀酰-甘氨酰-脯氨酸-4-甲基-7-香豆素为底物,确定PEP的最适pH 6.0和最适温度35℃。温度变化对PEP活力的影响较大,通过圆二色谱检测显示加热对PEP的二级结构有较为明显的影响,且热变性不可逆。通过分子克隆技术获得PEP全长cDNA开放阅读框含2226个核苷酸,编码741个氨基酸残基,预测分子质量为84.12 kDa。通过同源建模得到鲈鱼PEP的分子结构,PEP为典型的α/β水解酶折叠排列,其催化三联体(His-711、Asp-672、Ser-585)被β-折叠形成的螺旋桨区域的中心通道所覆盖。催化活性中心空间构象稳定对维持PEP活力至关重要,而其独特的分子结构是底物特异性的基础。

重组鲍鱼肌肉脯氨酰内肽酶的性质研究

为研究皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)中脯氨酰内肽酶(Prolyl endopeptidase,Hdh-PEP)的酶学特性与结构特性,利用基因工程技术重组并在大肠杆菌中高效表达了皱纹盘鲍PEP。原核表达的Hdh-PEP分子量为85 kDa,在pH2~6、温度20~60℃条件下,Hdh-PEP的表面疏水性明显升高。氨基酸序列同源性分析结果表明,HdhPEP催化结构域中有三个高度保守的氨基酸序列:Seq 1:K-D-G-T-K/R-I-P、Seq 2:Y-G-Y-G-G-F和Seq 3:I-RG-G-E-Y/F。酶动力学研究表明,Hdh-PEP的米氏常数Km为5.32μmol/L,催化常数kcat值为15.7 s-1。PEP的特异性抑制剂SUAM-14746和ZPP对Hdh-PEP酶活力具有强抑制作用,丝氨酸蛋白酶抑制(PMSF)对Hdh-PEP酶活力也有较大程度的抑制作用。本实验制备了高特异性抗Hdh-PEP多克隆抗体,可检测鲍鱼肌肉中天然PEP的存在情况。Hdh-PEP的体外高效表达和特异性多克隆抗体制备为后续深入研究Hdh-PEP的性质提供了重要参考。

脯氨酰内肽酶的研究进展

脯氨酰内肽酶(PEP)作为外源蛋白表达的宿主系统在工业上广泛应用,因其优良的功能特性而具有重要的研究价值。近年来,大量学者对PEP酶学特性、作用机制、异源表达和分子改造等特性及其应用等方面进行了相当多的研究,其在生物学科的应用得到了广泛的重视。本文对于PEP在食品、医药领域的应用进行了探讨,为PEP的高效利用提供理论依据。

圆二色谱法分析金属离子对鲍鱼脯氨酰内肽酶的作用

使用原核表达系统表达了皱纹盘鲍( Haliotis discus hannai )脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP),并对其进行高度纯化。SDS-PAGE结果表明,该酶的相对分子质量约为85 ku,其二级结构主要由α-螺旋(28.3%)、反向平行结构(17.4%)、平行结构(8.70%)、β转角(19.0%)、无规卷曲(28.5%)组成。选取PEP特异性荧光底物Suc-Gly-Pro-MCA测定其活性,并选取了多种常见金属盐溶液对其进行抑制作用分析。结果发现,Al^3+、Cu^2+、 Zn^2+、Ag^+和 Pb^2+能够抑制PEP的活性。利用圆二色谱法,对金属离子作用下PEP的二级结构变化进行分析和计算。分析结果表明,不同金属离子对PEP的作用效果不同:Al^3+、Cu^2+和Zn^2+在影响PEP结构时也影响其活性;Ca^2+、Mg^2+对PEP的结构和活性均不产生明显影响,而Ag^+和 Pb^2+可在不影响PEP二级结构的前提下抑制其活性。

丙戊酸钠抑制脯氨酰内肽酶活性对非酒精性脂肪性肝病进展的影响

目的:探索丙戊酸钠对高脂高胆固醇饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型小鼠的影响。方法:随机选取42只7~8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为对照组、模型组和干预组。对照组饲以标准饲料,模型组及干预组饲以高脂高胆固醇饲料,8周后干预组给予丙戊酸钠(0.4%丙戊酸钠饮用水),对照组和模型组给予常规饮用水,继续干预8周后处死小鼠。观察小鼠体质量、肝指数、血清生化指标和肝组织病理学改变,并探究其与脯氨酰内肽酶(PREP)之间的关系。结果:与对照组比较,模型组小鼠的体质量、肝指数、脂睾指数均显著升高(P<0.05);与模型组相比,干预组肝指数显著下降(P<0.05),但体质量、睾脂指数差异无统计学意义(P>0.05)。模型组小鼠血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素均显著高于对照组(P<0.05);干预组小鼠血清TC、TG、ALT较模型组显著下降(P<0.05),LDL、谷草转氨酶(AST)、ALP、FBG、胰岛素与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组小鼠肝脏出现明显的脂肪变性、炎症及气球样变,经丙戊酸钠干预后,脂肪变性和炎症明显改善,NAFLD活动度积分(NAS)显著下降(P<0.05)。模型组肝组织PREP mRNA RQ值为2.02±0.13,PREP蛋白活性为(473.39±15.41)pmol·mg^(-1)·min^(-1),均较对照组高(P<0.05);干预组肝组织PREP mRNA RQ值为1.86±0.18,与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);干预组PREP蛋白活性为(397.41±9.63)pmol·mg^(-1)·min^(-1),较模型组低(P<0.05);三组之间肝组织PREP蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:丙戊酸钠能通过抑制PREP活性改善NAFLD模型小鼠肝脏的脂肪变性和炎症。

脯氨酰内肽酶检测方法及抑制剂构效关系研究

脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PREP)是一种重要的丝氨酸蛋白水解酶,特异性水解多肽链中脯氨酸羧基端的肽键,参与神经肽的代谢调节,其活性与多种精神类疾病的发生发展密切相关。人体内PREP活性异常可能是阿尔茨海默病易感性的标志。总结PREP活性检测方法及其抑制剂的研究进展:检测方法方面,生化分析方法主要包括探针底物及其分析条件和动力学参数;抑制剂方面,根据来源和结构骨架分类归纳,包括黄酮类、生物碱类、萜类、菲醌类、脯氨酸类、硼酸类、噻唑类和其他类;通过进一步探讨PREP抑制剂的构效关系,以期为PREP抑制剂的高通量筛选及研发提供参考。

烟曲霉脯氨酰内肽酶在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达与重组酶性质

【目的】研究烟曲霉脯氨酰内肽酶cDNA基因的异源表达及重组酶性质。【方法】以烟曲霉CICIM F0044总RNA为模板,反转录合成cDNA;再以cDNA为模板,通过PCR扩增去除自身信号肽的脯氨酰内肽酶基因,构建表达载体pPIC9K-PEP;电转化酵母宿主菌Pichia pastoris GS115,获得重组菌PEP-09;纯化并分析重组酶性质。【结果】重组菌摇瓶发酵酶活力最高可达647.3 U/L。表达产物纯化后的分子量为63 kD左右。重组酶最适反应温度为65°C,有较好的温度稳定性,在55°C保温8 h能保留90%以上的酶活力。该酶最适pH为5.5,在pH 3.0 9.0范围内有很好稳定性,在pH 6.0 8.0的缓冲液中37°C保温10 d酶活没有明显变化。【结论】烟曲霉脯氨酰内肽酶cDNA基因在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌表达,重组酶活性稳定,有一定的应用潜力。

重组脯氨酰内肽酶提取方法改进及活性研究

脯氨酰内肽酶具有水解多肽中脯氨酰残基的能力,具有治疗乳糜泻的潜力,构建高表达量的重组脯氨酰内肽酶、建立保持其高活性的提取方法对于脯氨酰内肽酶的药物开发至关重要。该研究经密码子优化、基因合成,构建了重组鞘氨醇单胞菌脯氨酰内肽酶(SCPEP)的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。探索建立改进型渗透休克法提取SCPEP,经Ni-NTA纯化、超滤浓缩得到产物。采用分光光度法基于底物Suc-Ala-Pro-pNA评价SCPEP的活性,同时与高压均质法提取的产物进行对比研究。结果显示,在pH 6. 0和pH 7. 0的反应体系中,采用改进型渗透休克法提取的SCPEP水解Suc-Ala-Pro-pNA的kcat/KM分别为(56. 58±12. 00)(mmol/L)-1·s-1和(55. 82±15. 33)(mmol/L)-1·s-1,而高压均质法提取的SCPEP水解Suc-Ala-Pro-pNA的kcat/KM分别为(24. 78±10. 63)(mmol/L)-1·s-1和(48. 69±13. 79)(mmol/L)-1·s-1,改进型渗透休克法提取的SCPEP在pH6. 0和pH 7. 0下的活性比高压均质法提取的SCPEP高2. 30和1. 15倍,故改进型渗透休克法有利于提取的SCPEP保持更高的活性。

长叶乌头根中的脯氨酰内肽酶抑制剂

在筛选药用植物的生物活性成分过程中，对长叶乌头(Lindera strychnifolia)根中的脯氨酰内肽酶(PEP，EC3．4．21．26)抑制成分进行了研究，从中分离得到4个已知倍半萜和2个已知鞣质，并用来源于脑膜脓毒性黄杆菌和大鼠脑上清液的PEP对其抑制活性进行研究。