脯氨酰异构酶1沉默抑制缺氧/复氧H9c2心肌细胞凋亡

目的:肽基脯氨酰顺反异构酶1(Pin1)在心血管疾病发病过程中发挥重要作用,本研究检测RNA干扰沉默Pin1对缺氧/复氧诱导的大鼠胚胎心肌细胞H9c2凋亡的影响及机制。方法:体外培养大鼠H9c2细胞,建立缺氧/复氧损伤模型,模拟体内缺血再灌注损伤;RT-q PCR和Western blot法检测Pin1的表达;将细胞分为空白对照组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧组+转染Pin1 siRNA组、缺氧/复氧组+转染scramble siRNA组;MTT法测H9c2细胞存活率;用流式细胞术Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率;用Western blot法检测H9c2细胞Bax和Bcl-2蛋白表达;生化法检测Caspase-3的活性水平。结果:Pin1在缺氧/复氧H9c2细胞中呈现高表达;转染Pin1 siRNA后,Pin1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,Pin1 siRNA组的细胞存活率增加,凋亡率降低,Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低,Bcl-2/Bax升高,Caspase-3活性降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:Pin1下调可减少缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡,可能是通过上调Bcl-2,下调Bax蛋白表达,降低Caspase-3活性而发挥作用。

维生素D通过抑制Pin1介导线粒体氧化应激拮抗高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡

目的:观察维生素D对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)氧化损伤的作用,对脯氨酰异构酶1(Pin1)蛋白表达和活性、p66Shc线粒体转位及活性氧簇(ROS)生成的影响,以及维生素D受体(VDR)在这一过程的作用。方法:以33 mmol/L葡萄糖干预建立高糖内皮细胞损伤模型,分别接受维生素D(10^(-8)~10^(-6)mol/L)和Pin1抑制剂胡桃醌(10^(-7)mol/L)共孵育;流式细胞术和TUNEL染色法检测HUVECs的凋亡率;流式细胞术和荧光显微术检测细胞内的ROS水平;Western blot法检测HUVECs中Pin1、p66Shc、p-p66Shc、p66Shc胞浆/线粒体比值及caspase-3的蛋白水平;多肽酶解法测定HUVECs裂解液中Pin1的活性;通过转染siRNA沉默VDR的表达,观察VDR是否介导Pin1蛋白及活性改变。结果:维生素D(10^(-8)~10^(-6)mol/L)抑制高糖诱导的HUVECs凋亡,并抑制高糖诱导的HUVECs中Pin1蛋白表达和活性增加。维生素D抑制高糖诱导的HUVECs中p66Shc磷酸化、p66Shc线粒体转位、ROS生成及caspase-3蛋白表达(P<0.05)。通过转染siRNA沉默VDR表达,可削弱维生素D对高糖诱导的HUVECs中Pin1蛋白表达和活性增加的抑制作用。结论:维生素D通过激动VDR,抑制高糖环境下Pin1蛋白表达和活性增加,抑制p66Shc的线粒体转位,减少ROS生成,从而减轻血管内皮细胞凋亡。

Pin1和β-连环素在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨肽酰脯氨酰异构酶1(Pin1)与β-连环素在胃癌发生、发展中的作用。方法应用免疫组化SP技术对50例胃癌组织(胃癌组)及30例正常胃组织(对照组)中Pin1、β-连环素表达进行检测,分析两指标间相关性及与胃癌临床病理学特征的关系。结果胃癌组及对照组Pin1表达阳性率分别为24.0%(12/50)、0,β-连环素异常表达率分别为62.0%(31/50)、23.3%(7/30),P均<0.05;Pin1与β-连环素在胃癌组织中的表达密切相关(r=0.51,P<0.01);Pin1及β-连环素表达与胃癌病理分化程度、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。结论Pin1和β-连环素异常表达可能在胃癌发生、发展中起重要作用,可作为指导肿瘤治疗及判断转移、预后等的参考指标之一。

PPIL1蛋白在肝癌组织的表达及临床意义

目的研究肝癌组织中肽酰脯氨酰异构酶(亲环素)样1(PPIL1)表达水平,及其在肝癌组织中表达的临床意义。方法运用免疫组织化学方法和实时荧光定量PCR技术,检测80例肝细胞癌及癌旁组织中PPIL1蛋白和mRNA表达情况,并分析其与临床指标、病理学特征的关系。结果 PPIL1蛋白主要表达于细胞浆,在肝癌组织中表达水平明显高于癌旁组织,在肿瘤分期较晚、分化程度较差以及有转移的病例中表达较高,差异有统计学意义(P<0.05),PPIL1mRNA表达水平与蛋白表达水平趋势一致(P<0.05)。结论在肝癌组织中,PPIL1高表达对肿瘤的发生发展和浸润转移起到一定的促进作用,是潜在的治疗靶点。

PiB对胶质瘤细胞增殖与侵袭能力的影响

目的探讨PIN1抑制剂Pi B对U87胶质瘤细胞系增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法人胶质瘤细胞系U87常规培养,取对数生长期细胞进行试验,以1.0μmol/L Pi B处理U87细胞48 h为实验组,未经任何处理的U87细胞作为对照组。RT-PCR和Western blotting检测PIN1基因的m RNA和蛋白表达。免疫荧光检测阳性细胞数。Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的改变。MTT比色法检测Pi B对细胞增殖的抑制作用。结果与对照组相比,实验组细胞PIN1基因的m RNA和蛋白表达水平明显下调,PIN1阳性细胞数明显减少,细胞抑制率明显,且与药物剂量和作用时间成相关性,细胞迁移和侵袭能力下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Pi B可靶向抑制PIN1基因的m RNA和蛋白水平表达,进而抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力。

胶质瘤中PIN1-Nanog相关通路表达的研究

目的 观察肽基脯氨酰异构酶1（PIN1）、Nanog在胶质瘤组织中的表达以及PIN1抑制剂PiB对U87细胞增殖能力及PIN1、Nanog表达的影响. 方法 选取安徽医科大学附属省立医院神经外科自2013年3月至2014年8月间手术切除的84例胶质瘤和10例正常脑组织标本,免疫组化染色检测标本PIN1、Nanog蛋白的表达.体外常规培养U87胶质瘤细胞,用0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL PiB分别作用24、48 h,MTT检测PiB对细胞增殖的抑制作用并计算抑制率;以1.0μmol/L PiB处理U87细胞24 h为1.0 μmol/L PiB组,未经任何处理的U87细胞作为对照组,免疫荧光双染检测细胞PIN1、Nanog的表达,RT-PCR和Westem blotting分别检测细胞PIN1、Nanog mRNA和蛋白的表达. 结果 WHOⅡ级、Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤中PIN1、Nanog高表达率不同,差异有统计学意义（P＜0.05）,且胶质瘤级别越高,PIN1、Nanog高表达率越高.MTT检测显示PiB对U87细胞的增殖有抑制作用,且呈时间和剂量依赖性.与对照组比较,1.0 μmol/L PiB组PIN1、Nanog及PIN1/Nanog阳性细胞百分比降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;对照组和1.0 μmol/L PiB组细胞PIN1 mRNA的表达量分别为1.82±0.03和0.94±0.20,Nanog mRNA的表达量分别为1.47±0.04和0.82±0.19,差异均有统计学意义（P＜0.05）;对照组和1.0 μmol/L PiB组细胞PIN1蛋白表达量分别为2.96±0.05和1.15±0.26,Nanog蛋白表达量分别为1.52±0.16和0.75±0.05,差异均有统计学意义（P＜0.05）. 结论 PIN1、Nanog在胶质瘤的发生发展中起重要作用,且与肿瘤的恶性程度相关.PIN1可参与调控Nanog,两者之间存在相关通路,下调PIN1-Nanog通路后,胶质瘤细胞增殖能力下降.

Pin1介导血管内皮细胞氧化应激反应参与重症中暑急性肺损伤的机制研究

目的观察热打击后小鼠肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)和肺组织中肽基-脯氨酰顺/反异构酶1(Pin1)通过调控氧化应激和凋亡形成,参与重症中暑急性肺损伤(acute lung injury,ALI)形成的分子机制。方法体外实验,建立PMVECs热打击模型,对照组将PMVECs置于标准37℃、5%CO2细胞培养箱,热打击组将细胞置于43℃细胞培养箱中进行热打击2 h,热打击后继续在细胞培养箱进行复温(1、3、6、12 h),并使用Pin1抑制剂Juglone(1µmol/L)预处理细胞1 h。体内实验,通过热打击构建重症中暑小鼠模型,热打击组动物置于仿真气候舱内,舱内温度(35.5±0.5)℃,湿度(60±5)%,肛温表监测小鼠直肠温度,小鼠体温达到42℃即停止热打击,热打击后1、3、6以及12 h处死动物,对照组小鼠始终置于室温(25±0.5)℃下,并使用Pin1抑制剂Juglone(1 mg/kg)于热打击前连续3 d腹腔注射对小鼠进行预处理。Western blot观察Pin1、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达情况;DHE染色,荧光显微镜下观察细胞中O_(2)^(-)˙水平;ELISA检测肺组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平;HE染色检测各组小鼠的病理改变情况;免疫组化染色检测各组小鼠肺组织中Pin1表达情况;TUNEL染色检测各组小鼠肺组织凋亡情况。结果热打击后复温1 h即可诱导PMVECs和肺组织中Pin1的表达,并呈现复温时间依赖性增加(F=771.6,P<0.05;F=1035,P<0.05);热打击后复温3 h开始PMVECs和肺组织中cleaved caspase-9的表达,并呈现复温时间依赖性增加(F=729.8,P<0.05;F=1773,P<0.05);PMVECs和肺组织中cleaved caspase-3在热打击后复温3 h开始表达,随着复温时间的延长其表达不断增多,趋势与cleaved caspase-9一致(F=1084,P<0.05;F=1252,P<0.05);同时,热打击后导致PMVECs中O_(2)^(-)˙释放。热打击后小鼠肺组织中氧化-抗氧化系统失衡,表现为热打击后小鼠肺组织中MDA的持续释放(F=114.2,P<0.05),而SOD水平持续抑制(F=99.15,P<0.05)。使用Pin1抑制剂Juglone对PMVECs和小鼠进行预处理,发现与热打击组相比,热打击+Juglone组PMVECs和肺组织中Pin1、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3均被抑制(均P<0.05);使用Pin1抑制剂后明显减轻热打击后PMVECs中O_(2)^(-)˙的释放,促进重症中暑小鼠肺组织中氧化-抗氧化系统平衡恢复,与热打击组相比,热打击+Juglone组肺组织中MDA被抑制[(11.53±0.84)nmol/mL vs(9.65±0.69)nmol/mL,t=12.52,P<0.05],而SOD明显恢复[(41.18±3.45)U/mL vs(57.52±4.83)U/mL,t=5.57,P<0.05]。同时,抑制Pin1表达后可以明显减轻热打击后肺组织的病理损伤,以及抑制凋亡的发生。结论初步确认Pin1主要通过介导肺组织和PMVECs的氧化应激反应和凋亡发生,进而参与热打击后肺损伤的形成.