发酵条件对拟青霉E7菌株产脱乙酰几丁质酶的影响

以脱乙酰几丁质为惟一碳源和氮源,通过平板透明圈筛选法,从土壤中筛选分离了30株产脱乙酰几丁质酶的菌株,根据产生透明圈的大小和酶活测定,从中选出产脱乙酰几丁质酶活力最高的拟青霉E7菌株进行产酶发酵条件的进一步研究。结果表明,0.5%￣1%的脱乙酰几丁质浓度有利于产酶,高于2%则对其产酶有抑制作用;金属离子对酶活力有一定的影响,在基本培养基中添加Mn2+对产酶有较强的诱导作用,而加入Ca2+则对产酶有一定的抑制作用;以蛋白胨为氮源时,产酶活力最高,可达到60U·mL-1;pH对E7菌株的产酶活力影响较大,方差分析表明,不同pH值的产酶活力存在显著差异(a=5%),pH在4.0￣6.0范围内酶活力较稳定,pH高于6.0酶活力很低,不利于产酶。

枯草芽孢杆菌XF-1中脱乙酰几丁质酶在大肠杆菌中的表达及其抑菌活性

根据脱乙酰几丁质酶同源基因序列设计引物,扩增、克隆和测序了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株XF-1的脱乙酰几丁质酶基因(csn)。该基因编码区为834bp,编码由277个氨基酸组成的约30kD的蛋白质,其基因序列与枯草芽孢杆菌菌株B168的脱乙酰几丁质酶基因的相似性达到99%,氨基酸序列相似性为98%,在第19、47、60、256和257位的氨基酸发生了变化,分别由异亮氨酸代替了菌株B168脱乙酰几丁质酶中的甲硫氨酸、缬氨酸代替了谷氨酸、苏氨酸代替了异亮氨酸、天冬氨酸代替了谷氨酸、赖氨酸代替了天冬酰胺。菌株XF-1对稻瘟病菌Magnaporthe oryzae和芸薹根肿菌Plasmodiophora brassicae有抑制作用,而菌株B168没有。菌株XF-1和B168的csn基因在大肠杆菌Escherichia coli中的表达产物均具有脱乙酰几丁质酶活性,但前者的表达产物对稻瘟病菌及芸薹根肿菌具有抑制作用,而后者没有。表明脱乙酰几丁质酶是XF-1抑制根肿病作用机制之一,且上述5个氨基酸替代可能与抑菌机制有关。

脱乙酰几丁质酶降解产物的纸层析分析

对本实验室筛选保存的几株产脱乙酰几丁质酶菌株的产酶条件,如pH值、氮源和金属离子进行初步研究,结果表明,其酶作用最适pH范围为5.0～6.0,氮源及Cu2+、Co2+和Mn2+对脱乙酰几丁质酶有不同程度的促进作用,Zn2+对脱乙酰几丁质酶有较强的抑制作用。用纸层析测定这些菌株在不同产酶条件下发酵产物中壳寡糖的含量和成分,根据产物情况推测酶作用方式,表明不同条件下得到壳寡糖有所变化。

烟曲霉脱乙酰几丁质酶cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究

将烟曲霉的一种胞外脱乙酰几丁质酶（AF CSN）纯化，并测定该酶N-端氨基酸的序列。用此序列推测的寡核苷酸引物扩增得到脱乙酰几丁质酶（csn）的cDNA，其全长为804bp，编码一种251个氨基酸的单肽，对csn的序列比较分析表明，它与茄病镰刀菌在两个区域具有同源性，这两个区域分别有重复天冬氨酸及苏氨酸残基，这说明它与细菌具有相同的演化起源。cns与已知的细菌脱乙酰几丁质酶没有同源性，Southern杂交分析显示，cns在烟曲霉基因组中的单拷贝的。用质粒栽体pET28a(t),csn cDNA被导入E.coli中得到csn的融合蛋白，在IPTG诱导下，E.coli细胞中可获得大量的约28kDa的成熟蛋白。

烟曲霉脱乙酰几丁质醇cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究

将烟曲霉的一种胞外脱乙酰几丁质酶纯化，并测定该酶Ｎ－端氨基酸的序列。用此序列推测的寡核苷酸引物扩增得到脱乙酰几丁质酶的ｃＤＮＡ，其全长为８０４ｂｐ，编码一种２５１个氨基酸的单肽，对ｃｓｎ的序列比较分析表明，它与茄病刀菌在两个区域具有同源怀。