脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶/羟化酶基因cefEF的克隆及序列分析

利用氯化苄分别从真菌顶头孢 (Cephalosporiumacremonium)和产黄头孢 (Acremoniumchrysogenum)中提取总DNA ,通过PCR方法扩增脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶 羟化酶基因cefEF ,结果只能从产黄头孢DNA中扩增出cefEF基因。测序结果表明 ,其与已报道的基因序列只有 3个碱基的差异 ,推断的氨基酸序列只有 2个氨基酸有差异 ,并未涉及活性中心。同时表明 ,国外所指的与该酶有关的顶头孢 (Cephalosporiumacremonium或Acremoniumchryso genum)对应的是国内的产黄头孢 (Acremoniumchrysogenum)。

枯草芽孢杆菌头孢菌素C脱乙酰基酯酶在大肠杆菌中的诱导及组成型表达

本研究构建了8种诱导型质粒和16种组成型质粒,试图实现枯草芽孢杆菌头孢菌素C脱乙酰基酯酶(CAH)基因在大肠杆菌中的高效异源表达。经过筛选,最终选择带有pUC19上的起始位点、SIL_3基因、trp启动子以及间隔序列为B1的组成型表达质粒p B1-SIL_3-K为最佳表达质粒。将PB1-SIL_3-K转入Escherichia coli DH5α,重组菌在37℃发酵培养24 h,其OD值达到5.4,酶活达到了138.61 U/mL。进一步通过培养基组成、培养条件、放大过程等优化,在7 L发酵罐上,CAH最高酶活达到1 340 U/mL,为目前国内外文献报道最高水平。

7-苯乙酰胺基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸裂解工艺的改进

青霉素氧化物扩环后，扩环酸母液直接裂解合成７－氨基脱乙酰氧头孢烷酸（７－ＡＤＣＡ），收率提高４１％。

固定化酶解法合成7-ACA的方法研究

天然类头孢菌素C通过化学法或酶解法可制得半合成头孢菌素的重要母核7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。主要研究头孢菌素C在自制固定化CA-Co-Fe/KIT-6催化下,通过一步裂解制备7-ACA的方法,先自行合成负载Co-Fe活性组分的KIT-6载体,再将头孢菌素脱酰酶(CA)通过物理吸附固定在Co-Fe/KIT-6上。经过正交实验,优化了7-ACA的制备条件:温度28℃,p H 8. 0,底物浓度4%,固定化CA酶用量0. 3 g,时间40 min,反应液中7-ACA浓度93. 5%,收率84. 3%。第5次使用经离心回收的固定化CA-Co-Fe/KIT-6,其相对酶活性为87. 6%,7-ACA收率为78. 4%。

棒状链霉菌扩环酶R306位点的定点突变

目的:通过对棒状链霉菌的脱乙酰氧基头孢菌素C合酶(DAOCS)C末端R306位点突变,改变酶的活力和底物专一性。方法:利用生物信息学和空间结构分析推测,利用定点突变技术,对DAOCS的C-末端R306位点进行定点突变。结果:将DAOCS的C末端R306位点突变为其它3种性质相异的氨基酸,显示酶的活力和底物专一性都有一定改变。结论:DAOCS的C末端修饰对于提高酶活力或改变酶的底物专一性是一个非常有效的策略。

扩环酶的研究进展及其应用前景

扩环酶，也叫脱乙酰氧基头孢菌素Ｃ合成酶，催化青霉素Ｎ 扩环生成脱乙酰氧基头孢菌素Ｃ，是头孢菌素生物合成中的关键酶。在真菌中它是一个双功能酶，同时具有扩环酶和羟化酶的活性；而在细菌中扩环和羟化却是由两个独立的酶来承担的。近年来，扩环酶被纯化成均一蛋白，有关它的性质、分子结构以及基因结构等方面的研究都取得了飞速发展，并不断地应用基因工程的技术探索其在抗生素生产上的应用。

扩环酶在头孢菌素类抗生素生产中的应用进展

扩环酶是一类典型的铁(Ⅱ)/2-酮戊二酸依赖性双加氧酶,该酶最主要的特点是能将青霉素的五元四氢噻唑环扩环为六元二氢噻嗪环结构,从而生成头孢菌素。文章阐述了扩环酶的来源,并以来自棒状链霉菌的去乙酰氧基头孢菌素C合酶和来自顶头孢霉的去乙酰头孢菌素C合成/羟化酶作为主要研究对象,详细介绍了扩环酶的结构特性、作用机制及酶修饰工作,总结出对青霉素G扩环效率较好的氨基酸位点突变。此外,由于去乙酰氧基头孢菌素C合酶可以将青霉素N扩环生成去乙酰氧基头孢菌素C,去乙酰头孢菌素C合成/羟化酶可以将青霉素N扩环生成去乙酰头孢菌素C,导致两种扩环酶具有不同的工业用途,因此文章还对当前扩环酶的工业应用进展进行总结,为提高酶法生产头孢菌素类抗生素及其医药中间体的产量提供了现实依据。