脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶/羟化酶基因cefEF的克隆及序列分析

利用氯化苄分别从真菌顶头孢 (Cephalosporiumacremonium)和产黄头孢 (Acremoniumchrysogenum)中提取总DNA ,通过PCR方法扩增脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶 羟化酶基因cefEF ,结果只能从产黄头孢DNA中扩增出cefEF基因。测序结果表明 ,其与已报道的基因序列只有 3个碱基的差异 ,推断的氨基酸序列只有 2个氨基酸有差异 ,并未涉及活性中心。同时表明 ,国外所指的与该酶有关的顶头孢 (Cephalosporiumacremonium或Acremoniumchryso genum)对应的是国内的产黄头孢 (Acremoniumchrysogenum)。

固定化酶解法合成7-ACA的方法研究

天然类头孢菌素C通过化学法或酶解法可制得半合成头孢菌素的重要母核7-氨基头孢烷酸(7-ACA)。主要研究头孢菌素C在自制固定化CA-Co-Fe/KIT-6催化下,通过一步裂解制备7-ACA的方法,先自行合成负载Co-Fe活性组分的KIT-6载体,再将头孢菌素脱酰酶(CA)通过物理吸附固定在Co-Fe/KIT-6上。经过正交实验,优化了7-ACA的制备条件:温度28℃,p H 8. 0,底物浓度4%,固定化CA酶用量0. 3 g,时间40 min,反应液中7-ACA浓度93. 5%,收率84. 3%。第5次使用经离心回收的固定化CA-Co-Fe/KIT-6,其相对酶活性为87. 6%,7-ACA收率为78. 4%。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶核转位与高糖应激诱导的H9c2细胞凋亡密切相关

目的:探讨高糖应激是否引起心肌细胞中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)核转位以及GAPDH核转位是否与细胞凋亡有关。方法:高糖培养H9c2细胞48 h后,收集细胞进行细胞凋亡的测定,用DCFH-DA荧光探针测定细胞中活性氧簇(ROS)的水平,用Western Blotting方法测定细胞质和细胞核中GAPDH以及细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,用细胞免疫荧光的方法测定GAPDH的核转位情况。结果:与低糖培养组相比,高糖培养组H9c2细胞凋亡率增高,ROS生成和iNOS表达增多,GAPDH由细胞质向细胞核转位;而线粒体呼吸链复合体I抑制剂鱼藤酮和iNOS抑制剂1400W均阻断GAP-DH的转位,并减少高糖诱导的H9c2细胞的凋亡。结论:高糖诱导H9c2细胞中GAPDH由细胞质向细胞核转位;鱼藤酮和1400W可抑制高糖Flavonoids诱导的细胞凋亡,这一作用与抑制GAPDH核转位有关。

农杆菌转化法高效构建顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株提高头孢菌素C产量

目的获得顶头孢霉sorA和sorB双缺失菌株,以阻断sorbicillinoids的合成,并研究其与头孢菌素C(CPC)产量的关系。方法通过根癌农杆菌转化法,依据同源双交换的原理,同时敲除合成sorbicillinoids骨架结构的两个聚酮合酶基因sorA和sorB,并通过摇瓶发酵实验检测缺失菌和野生菌的产量。结果筛选并验证了6株A.chrysogenum-Δpks菌株,遗传稳定,转化效率约为20%。通过发酵实验测定发现,缺失菌株产CPC能力比野生菌提高了70%。结论农杆菌转化法是一个高效的顶头孢霉遗传操作系统,并且顶头孢霉中sorbicillinoids的缺失可以提高CPC产量。

棒状链霉菌扩环酶R306位点的定点突变

目的:通过对棒状链霉菌的脱乙酰氧基头孢菌素C合酶(DAOCS)C末端R306位点突变,改变酶的活力和底物专一性。方法:利用生物信息学和空间结构分析推测,利用定点突变技术,对DAOCS的C-末端R306位点进行定点突变。结果:将DAOCS的C末端R306位点突变为其它3种性质相异的氨基酸,显示酶的活力和底物专一性都有一定改变。结论:DAOCS的C末端修饰对于提高酶活力或改变酶的底物专一性是一个非常有效的策略。

维生素C对脂质过氧化损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用

为探讨维生素C对脂质过氧化损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用及其可能的分子作用机制 ,在铜离子诱发的低密度脂蛋白氧化修饰的基础上 ,造成内皮细胞的脂质过氧化损伤模型 ,测定细胞上清液中和细胞内乳酸脱氢酶的活性及其乙酰胆碱诱发的内皮型一氧化氮合酶活性及一氧化氮的生成量。结果发现 ,脂质过氧化物明显增加上清液中乳酸脱氢酶活性 (P <0 .0 1 ) ,增加细胞死亡率 (P <0 .0 1 ) ;同时它也抑制内皮型一氧化氮合酶的活性(P <0 .0 1 ) ,具有剂量 -依赖效应。应用不同剂量的维生素C(浓度为 1 0 0 μmol L和 30 0 μmol L)后 ,该效应明显减弱 ;内皮型一氧化氮合酶活性与一氧化氮生成量之间呈正相关 ,r值分别为 0 .9844(P <0 .0 1 )和 0 .880 2 (P <0 .0 5)。由此提示 ,脂质过氧化物能直接损伤内皮细胞 ,抑制内皮型一氧化氮合酶活性 ;

扩环酶的研究进展及其应用前景

扩环酶，也叫脱乙酰氧基头孢菌素Ｃ合成酶，催化青霉素Ｎ 扩环生成脱乙酰氧基头孢菌素Ｃ，是头孢菌素生物合成中的关键酶。在真菌中它是一个双功能酶，同时具有扩环酶和羟化酶的活性；而在细菌中扩环和羟化却是由两个独立的酶来承担的。近年来，扩环酶被纯化成均一蛋白，有关它的性质、分子结构以及基因结构等方面的研究都取得了飞速发展，并不断地应用基因工程的技术探索其在抗生素生产上的应用。

扩环酶在头孢菌素类抗生素生产中的应用进展

扩环酶是一类典型的铁(Ⅱ)/2-酮戊二酸依赖性双加氧酶,该酶最主要的特点是能将青霉素的五元四氢噻唑环扩环为六元二氢噻嗪环结构,从而生成头孢菌素。文章阐述了扩环酶的来源,并以来自棒状链霉菌的去乙酰氧基头孢菌素C合酶和来自顶头孢霉的去乙酰头孢菌素C合成/羟化酶作为主要研究对象,详细介绍了扩环酶的结构特性、作用机制及酶修饰工作,总结出对青霉素G扩环效率较好的氨基酸位点突变。此外,由于去乙酰氧基头孢菌素C合酶可以将青霉素N扩环生成去乙酰氧基头孢菌素C,去乙酰头孢菌素C合成/羟化酶可以将青霉素N扩环生成去乙酰头孢菌素C,导致两种扩环酶具有不同的工业用途,因此文章还对当前扩环酶的工业应用进展进行总结,为提高酶法生产头孢菌素类抗生素及其医药中间体的产量提供了现实依据。

新型植物灭螺剂HL对钉螺作用机制研究

目的通过观察新型植物灭螺剂HL对钉螺体内酶活性的影响,以期阐明HL类植物灭螺药物对钉螺的作用机理。方法将钉螺分别浸泡于25mg/L、50mg/L、100mg/L HL植物灭螺剂和去氯水中48h后,去壳、分离软体、置冰冻切片机切片,用酶组织化学方法显示乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、细胞色素C氧化酶(CCo)和一氧化氮合酶(NOS),观察其变化,并采用显微图像分析系统,通过比较灰度值定量测定其活性。结果钉螺LDH、SDH、AChE、CCo和NOS定位于肌纤维、口囊、表膜、神经节、消化腺、咽管等部位酶活性随浸泡HL灭螺剂浓度的增大而酶活性减弱越明显,且与对照组有显著差异。结论HL的灭螺作用机制可能是由于破坏钉螺体内神经效应与信息分子传递,以及抑制能量供应,最终引起钉螺死亡。其作用机制与氯硝柳胺相似。

低氧训练对骨骼肌p53及其调控的线粒体有氧代谢信号通路基因表达的影响

目的:探讨低氧训练对大鼠骨骼肌p53及其调控的线粒体有氧代谢信号通路基因表达的影响,以及对线粒体有氧氧化供能能力的影响。方法:30只雄性Wistar大鼠随机分为3组(n=10),低住低练组(LoLo)、高住高练组(HiHi)和高住高练低训组(HiHiLo)。以当地海拔1500 m为常氧环境,模拟海拔3500 m为低氧环境,各组大鼠按训练方案训练5周后,取股四头肌行匀浆及提取线粒体。Real-time PCR检测p53、细胞色素c氧化酶合成2(SCO2),细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)和谷氨酰胺酶2(GLS2)mRNA表达,Westem blot检测p53、SCO2、COXⅠ和GLS2蛋白表达;ELISA测定α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDHC),细胞色素c氧化酶(COX)及ATP合酶(ATP synthase)活性。结果:①与LoLo组比较,HiHi和HiHiLo组p53 mRNA水平显著升高(P<0.01),HiHiLo组p53蛋白表达水平显著下降(P<0.01);HiHi和HiHiLo组SCO2 mRNA水平和蛋白表达水平均显著升高(P<0.01);HiHiLo组COXⅠmRNA水平显著升高(P<0.01),HiHi组显著降低(P<0.01),HiHi组COXⅠ蛋白表达水平显著升高(P<0.05);HiHi和HiHiLo组GLS2 mRNA水平均显著升高(P<0.05,P<0.01),HiHiLo组GLS2蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。②与LoLo组比较,HiHi组ɑ-KGDHC和COX活性均显著降低(P<0.01,P<0.05),HiHiLo组均显著升高(P<0.01);HiHi和HiHiLo组ATP synthase总活性和特异性活性均显著升高(P<0.01)。结论:高住高练低训上调大鼠骨骼肌p53及其调控的线粒体有氧代谢信号通路相关因子基因转录水平,提高骨骼肌线粒体有氧氧化供能能力。