人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析。方法用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1。将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定。用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白。用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性。结果所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确。IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确。Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性。结论成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E.coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶与卵巢上皮性癌耐药相关性研究

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)与卵巢上皮性癌耐药性的相关性以及其在卵巢癌化疗耐药中的作用机制。方法应用免疫组织化学法对78例原发性卵巢上皮性癌组织和卵巢癌顺铂敏感株A2780、顺铂耐药株CP70中APE1的表达进行测定。结果APE1在卵巢上皮性癌组织中呈胞核表达、胞浆表达或核浆共同表达。化疗敏感组和耐药组的APE1表达强度间差异有统计学意义(P=0.045),核表达者化疗敏感率与浆表达、核浆表达者比较差异有统计学意义(P=0.037)。在卵巢癌顺铂耐药株CP70中APE1表达水平较顺铂敏感株A2780明显增高。结论APE1表达强度和定位与以铂类为基础化疗药物的敏感性相关,对卵巢癌的化疗疗效有提示作用,检测APE1对前瞻性预测化疗药物敏感性和判断化疗疗效具有一定的临床指导价值。

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的制备人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAPE1)单克隆抗体(mAb)并对其生物学特性进行鉴定。方法以hAPE1融合蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,运用细胞融合、克隆化技术和间接ELISA法获得并筛选针对hAPE1的杂交瘤细胞,以体内诱生法产生腹水,并用Protein G柱亲和纯化得到hAPE1 mAb。采用秋水仙素阻断法、Western blot和间接ELISA法鉴定mAb的染色体核型、特异性、种属交叉反应、亚类、效价和亲和力,并应用于免疫荧光、免疫细胞化学和免疫组化实验中评价mAb性能。结果获得2株分泌稳定、高特异性的hAPE1 mAb的杂交瘤细胞株2-G1和4-F6,其效价均超过1:107,Ig亚类分别是IgG2b和IgG3,亲和常数分别为1.8×10-7和3.4×10-5,与兔、小鼠、大鼠无种属交叉性。2-G1mAb可应用于免疫细胞化学、免疫细胞荧光和免疫组织化学等实验技术中。结论成功获得2株稳定分泌抗hAPE1mAb的杂交瘤细胞株,产生的mAb具有高纯度、高效价和高特异性的特性,能特异性识别hAPE1天然蛋白和融合蛋白,为开展多种免疫学实验及研究提供必要的物质基础。

基于远红外荧光标记的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶活性检测方法的建立

目的建立远红外荧光标记的脱嘌呤脱嘧啶(apurinic/apyrimidinic,AP)核酸内切酶活性检测方法。方法通过5'标记远红外荧光基团(IR700)合成得到AP核酸内切酶活性检测底物,并通过与经典的同位素法对比,检验此方法的可靠性、灵敏度及实用性。结果远红外荧光标记法较传统的同位素法检测AP核酸内切酶更为敏感(10%上升到30%),且操作时间从传统的1 d缩减至2 h。结论远红外荧光标记法检测AP核酸内切酶活性更敏感,且操作方便、无放射性污染,易于推广。

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶单克隆抗体抗原表位的鉴定及应用

目的：研究鉴定人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶单克隆抗体（hAPE1 mAb）的抗原表位,并建立定量检测hAPE1的ELISA一步法。方法：设计并合成APE1-15肽阵列,鉴定hAPE1 mAb 2-G1和4-F6的抗原表位,应用三维立体结构观察软件Molsoft.ICM-Pro模拟hAPE1 mAb抗原表位的立体结构;采用改良的过碘酸钠法标记抗体,以hAPE1 mAb为捕获抗体和酶标抗体,建立hAPE1的ELISA一步检测法。结果：APE1-15肽阵列检测结果和抗原表位三维结构显示,2-G1mAb的抗原表位对应为hAPE1天然蛋白氨基酸残基序列的76-90位和109-123位,位于氧化还原区域,为构象型抗原表位;4-F6 mAb的抗原表位对应为hAPE1天然蛋白氨基酸序列的109-147位,位于DNA修复内切酶活性区。ELISA一步法检测hAPE1蛋白的线性范围为8.0~200μg/L,最低检测限为2.0μg/L。平均批内变异系数为8.67%,平均批间变异系数为12.45%,平均回收率为105.47%。结论：hAPE1 2-G1 mAb和4-F6 mAb具有不同的抗原表位,成功建立的hAPE1 ELISA一步法为简便、快速、准确检测血清中hAPE1的含量奠定了基础。

脱嘌呤嘧啶核酸内切酶与肿瘤相关性研究进展

脱嘌呤嘧啶核酸内切酶 (APE)是一种具有DNA修复与氧化还原双功能的蛋白 ,在各种组织中普遍表达。其表达在肿瘤组织与正常组织比较 ,存在表达水平、部位的差异。肿瘤中该基因的突变并不多见 ,但存在一定数量的单核苷酸多态性 ,部分伴有氨基酸改变。APE还具有促进或抗凋亡作用 ,可调控活化蛋白 1(AP 1) ,对抑制肿瘤性克隆形成具有重要意义。

人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1在乳腺癌中的研究进展

在细胞内外各种生物因素的作用下,生物体基因组DNA出现累积损伤,一旦修复机制出现缺陷就可能引发癌症。在细胞修复DNA损伤后形成脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点时,人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)发挥关键作用,本文对于APE1基因与癌症的关系及其在乳腺癌中的研究现况做一综述。

人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1在三阴性乳腺癌中的表达研究

目的检测人类脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶1（apurinic／apyrimidinic endonuclease／redox effector factor1，APE-1／REF-1）在乳腺癌中的表达，分析其与乳腺癌的临床病理特征的关系，及APE-1对三阴性乳腺癌患者预后的影响。方法采用免疫组化Envision两步法检测323例乳腺癌中APE-1蛋白的表达，其中108例为三阴性乳腺癌。计数资料采用，检验和Fisher精确检验。采用Kaplan—Meier法进行生存分析及Log—rank检验进行生存率的比较，并用COX比例风险回归模型进行多因素分析。结果APE-1在乳腺癌组织较癌旁组织有更高的表达，且在非三阴性乳腺癌中与肿瘤大小、腋窝淋巴结状态、临床分期、雌激素受体、人类表皮生长因子2型受体的表达显著相关（P〈0．05）。在三阴性乳腺癌中，APE-1表达与肿瘤大小（P=0．006）呈正相关，且APE-1低表达组有较好的生存率（P=0．007）。腋窝淋巴结阳性的三阴性乳腺癌患者中，APE一1低表达组有较好的预后（P=0．042）。结论APE一1是影响三阴性乳腺癌患者预后的独立因子，可能成为三阴性乳腺癌的潜在治疗靶点。

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子1的研究进展

无嘌呤无嘧啶核酸内切酶 /氧化还原因子 1(APE/Ref- 1)具有修复 DNA损伤、影响氧化还原反应及调节转录因子DNA结合活性等功能 ,对细胞的生存有重要作用。近年来有关 APE/Ref- 1的研究在其基因、功能、分布以及与某些疾病尤其是神经系统疾病和肿瘤之间的关系等方面都取得了长足的进展 。

荧光分析法测定人体血液样品中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)的活性

目的:开发一种可快速、灵敏地检测生物样品中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)含量的荧光分析方法。方法:根据APE1所具有的脱碱基核酸内切酶活性,合成了一种用荧光基团与猝灭基团标记的含脱碱基位点的DNA荧光探针。在合适的缓冲体系下,APE1将该DNA探针水解并释放出荧光基团,根据荧光信号上升速率实现对APE1活性的定量检测。在此基础上,本研究改进了检测APE1时溶液缓冲液的条件,使得该荧光探针对APE1的响应更为灵敏,并进一步通过密度梯度离心法从人全血样品提取了外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用改进后的荧光探针法定量测定了其蛋白提取液中APE1的含量。最后,使用该荧光探针法测定了临床血液样本中APE1的含量。结果:本研究建立的方法对APE1的最低检测限和功能灵敏度均为0.005 U/mL(3 pg/mL),线性范围为6 pg/mL^1.2 ng/mL。利用该方法测定了8份人血液样品中PBMCs蛋白中APE1的含量,测得每微克PBMCs蛋白中APE1的含量分布为0.061~0.40 ng,平均含量为0.16 ng APE1,加标回收率为98%±5%( n =3)。用该方法对102份正常人(男51例、女51例,年龄59~75岁)血清样品中的APE1含量进行了检测,得到这些血清样品中APE1含量的分布范围为0.13~0.34 ng/mL,加标回收率为96%±15%( n =3)。结论:本研究发展的荧光分析法操作简便、灵敏度高、所需生物样品量小,能够快速、准确地测定血液等生物样本中的APE1含量,解决了原有方法检测低含量血清样品时误差较大的问题,有良好的临床检验应用前景。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1基因敲低人肺癌细胞A549构建及其对线粒体功能影响

目的建立脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1(APE1)基因敲低人肺癌细胞A549,并初步观察线粒体功能变化。方法 APE1基因shRNA序列与pSIREN-RetroQ慢病毒载体经酶切连接重组体(pSIREN-RetroQ-shAPE1),再与病毒包装质粒共转染293T细胞;收集病毒液并感染A549细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株A549^(shAPE1)。免疫印迹法检测稳定细胞株中APE1干扰效率。用双氧水处理A549^(shControl)和A549^(shAPE1)细胞24 h,分析细胞内ATP及活性氧(ROS)变化。结果经PCR和测序鉴定成功构建重组慢病毒载体pSIREN-RetroQ-shAPE1,免疫印迹法证实A549^(shControl)和A549^(shAPE1)稳定细胞株构建成功;双氧水处理后,A549^(shAPE1)细胞中ATP活性明显低于A549^(shControl)细胞(P<0.05),而ROS明显增加(P<0.01)。结论 APE1干扰可影响肺癌细胞中线粒体功能。

无嘌呤嘧啶核酸内切酶在胰腺癌组织的表达及其临床意义

目的研究胰腺癌组织APE的表达及其与临床肿瘤指标的关系。方法(1)通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测4株胰腺癌细胞株APEmRNA的表达;(2)收集37例手术切除的胰腺癌及12例相应癌旁胰腺组织石蜡标本,应用EnVision免疫组化法分别检测癌组织和癌旁胰腺组织APE的表达情况。结果4株胰腺癌细胞株均有APEmRNA表达;37例胰腺癌中APE阳性表达33例(89.2%),其中APE胞核阳性表达7例(21.2%),胞质阳性表达5例(15.2%),胞质及胞核均表达21例(63.6%)。12例癌旁胰腺组织导管及腺泡呈阴性表达,胰岛胞质呈阳性表达,胰腺上皮内瘤变呈胞核阳性表达。APE阳性率与肿瘤分化程度,肿瘤大小、淋巴及远处转移无关(P>0.1)。结论APE在胰腺癌组织中有较高的阳性表达率,检测其定位的特异性表达可能有助于胰腺癌的早期诊断。

萝卜硫素对脓毒症急性肺损伤大鼠氧化损伤及脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1表达的影响

目的评价萝卜硫素对脓毒症急性肺损伤大鼠氧化应激损伤及脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)表达的影响。方法按随机数字表法将60只Sprague-Dawley大鼠分成三组:假手术组、模型组和治疗组,每组各20只。假手术组仅进行剖腹和关腹操作,模型组和治疗组采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备大鼠脓毒症模型,治疗组大鼠在术后立即通过腹腔内注射给予50 mg/kg的萝卜硫素注射液,其余两组注入等量等渗NaCl溶液。于术后24 h右侧颈总动脉采集动脉血标本,然后处死大鼠取肺组织。光镜下观察病理学结果,测定肺组织湿/干比。同时,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肺组织匀浆标本谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)表达情况,采用蛋白质印迹法检测肺组织APE1的表达。结果苏木素-伊红(HE)染色结果显示,假手术组肺组织结构清晰,未见明显水肿以及炎症细胞浸润;与假手术组相比,模型组大鼠肺组织病理形态学损伤严重,而治疗组肺组织损伤较模型组有所减轻。三组大鼠肺组织湿/干比(3.49±0.26、5.56±0.20、4.96±0.15)、动脉氧合指数(453±23、232±22、332±11)、GSH[(8.57±0.26)、(4.36±0.08)、(6.23±0.20)mg/g]及SOD表达水平[(91.0±3.0)、(55.5±2.5)、(72.1±2.4)NU/mg]比较差异均有统计学意义(F=107.897、128.676、275.863、183.797,P均<0.001)。进一步两两比较发现,模型组、治疗组大鼠肺组织湿/干比较假手术组均显著上升(P均<0.05),治疗组肺组织湿/干比较模型组下降(P<0.05);而模型组、治疗组动脉氧合指数及氧化损伤指标GSH和SOD水平较假手术组均显著下降(P均<0.05),且治疗组较模型组均上升(P均<0.05)。蛋白质印迹法结果显示三组大鼠肺组织APE1表达水平比较差异有统计学意义(F=453.991,P<0.001),进一步两两比较发现模型组、治疗组大鼠肺组织APE1表达较假手术组均显著下降(P均<0.05),但治疗组较模型组明显上升(P<0.05)。结论萝卜硫素可减轻脓毒症大鼠急性肺损伤,其机制可能与改善肺组织氧化应激反应及上调APE1表达有关。

脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶1在肝细胞癌中的表达及其意义

肝癌（HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其癌变是一个多步骤的渐进过程。脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶（APE）1，可修复损伤的DNA。APE1又名氧化还原因子1（Ref-1），可调节许多转录因子的DNA结合活性。我们采用免疫组织化学及原位杂交方法检测APE1在HCC中的表达情况，旨在探讨APE1基因表达在HCC的发生及恶性转化中的作用与地位。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1在脂多糖介导肺微血管内皮细胞氧化反应中的调控作用

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)在脂多糖介导肺微血管内皮细胞(PMVECs)氧化反应中的调控作用。方法将体外培养人PMVECs分成4组:对照组(未加脂多糖的培养细胞)及各剂量脂多糖组(分别予以0.1、1、10μg/ml剂量脂多糖刺激培养细胞)。分别在脂多糖刺激6、12、24 h检测细胞内活性氧及一氧化氮的水平并进行比较。同时利用携带目的基因慢病毒载体转染PMVECs,将其分成对照组,脂多糖组,GFP组及APE1组。对照组为未加脂多糖的培养细胞,脂多糖组为1μg/ml剂量脂多糖刺激的培养细胞,GFP组为1μg/ml的脂多糖刺激培养慢病毒空载体转染的细胞,APE1组为1μg/ml的脂多糖刺激培养携带APE1基因慢病毒转染的细胞。在12 h检测细胞内活性氧、一氧化氮的水平以及细胞APE1的表达情况。结果与对照组比较,各剂量组脂多糖刺激6、12、24 h后一氧化氮及活性氧分泌明显上升(P均<0.05),且同一剂量组随着时间的推移,一氧化氮及活性氧分泌的比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。在转染PMVECs12 h后,脂多糖组APE1的表达明显低于对照组,而APE1组细胞APE1的表达较脂多糖组显著提高(P均<0.05)。与对照组相比,脂多糖组能够诱导PMVECs的一氧化氮及活性氧生成显著增加,而APE1组能够一定程度抑制一氧化氮及活性氧的产生(P均<0.05)。结论 APE1可通过抑制一氧化氮及活性氧的分泌从而减轻脂多糖介导PMVECs的氧化应激反应。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1在氧化应激介导大鼠肺微血管内皮细胞损伤中的调控作用

目的探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)在过氧化氢(H_2O_2)介导的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)氧化应激中的调控作用。方法分离培养大鼠PMVECs并分成4组:对照组(未加H_2O_2)及各剂量H_2O_2组(终浓度分别为50、100、200μmol/L的H_2O_2)。在H_2O_2刺激细胞24 h后检测细胞增殖活性、细胞内活性氧水平及APE1蛋白表达,同时检测100μmol/ml的H_2O_2刺激细胞24、48、72 h后APE1蛋白表达并比较。另外利用慢病毒载体转染构建APE1过表达PMVECs,将其分成对照组(未加H_2O_2),H_2O_2组(终浓度为100μmol/L的H_2O_2),H_2O_2+空载体转染组(100μmol/L的H_2O_2刺激慢病毒空载体转染的细胞)及H_2O_2+APE1转染组(终浓度为100μmol/L的H_2O_2刺激APE1过表达细胞),并在24 h检测细胞活性氧水平及细胞增值情况。结果不同剂量组H_2O_2刺激细胞24 h后,四组间细胞增殖活性、活性氧的水平和APE1蛋白表达相对值差异均有统计学意义(F=80.238、445.608、547.566,P均<0.001)。在100μmol/L的H_2O_2刺激细胞0、24、48和72 h后,APE1蛋白表达相对值的比较有统计学意义(F=422.324,P<0.001),且随时间增加APE1表达也逐渐下降[(0.781±0.043)、(0.611±0.026)、(0.407±0.014)、(0.272±0.013),P均<0.05]。在转染慢病毒载体后,H_2O_2组活性氧水平明显高于对照组[(86.4±1.2)vs.(56.4±0.9),P<0.05];而H_2O_2+APE1转染组细胞活性氧水平较H_2O_2组显著下降[(66.8±1.0)vs.(86.4±1.2),P<0.05],细胞增殖活性明显增加[(0.209±0.001)vs.(0.153±0.001),P<0.05]。结论 H_2O_2刺激可导致APE1蛋白表达下降,而上调APE1表达可增加细胞增殖活性,并抑制活性氧的产生。因此,APE1可能具有减轻H_2O_2介导的大鼠PMVECs氧化应激反应的作用。

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1基因与乳腺癌细胞对吉西他滨耐药的相关性研究

目的研究人乳腺癌MCF-7细胞株经吉西他滨处理后APE/Ref-1mRNA和蛋白表达的变化。方法以50 nmol·L-1吉西他滨处理乳腺癌MCF-7细胞,在处理后0,3,7,10,13和16天,测定细胞凋亡比例、存活细胞APE/Ref-1基因mRNA及蛋白表达情况。结果吉西他滨50 nmol·L-1干预后第0,3,7,10,13,16天,细胞APE/Ref-1 mRNA及蛋白表达水平均逐渐增加,与干预天数呈正相关,并与凋亡细胞比例的变化趋势一致。APE/Ref-1表达水平从第10天起明显增加,第16天达到最高(P<0.05)。并且干预至第10,13,16天后,细胞中的APE/Ref-1 mRNA和蛋白表达水平与药物干预前细胞相比有明显差别(P<0.05)结论 APE/Ref-1在乳腺癌化疗时表达明显增强,可能与化疗耐药性的产生有关。

脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶基因氧化还原功能区单核苷酸多态性在散发性大肠癌中存在意义的探讨

目的 探讨脱嘌呤 /嘧啶核酸内切酶 (aprimidinic/ apurinic endonuclease/ redox factor- 1,APEX)基因氧化还原功能区单核苷酸多态性与散发性大肠癌的关系。方法 采用变性梯度凝胶电泳筛选、DNA测序的方法检测 15 0例散发性大肠癌和 14 3名健康人外周血 APEX基因氧化还原功能区的基因突变或基因多态性。结果 在散发性大肠癌 APEX基因氧化还原功能区中共检出 2个多态性位点 ,分别为 4 5 3G→T和 12 4 7A→ G。4 5 3T和 12 4 7G的基因频率分别为 1.3%和 5 .7% ;对照人群中上述两位点的基因频率分别为 1.0 5 %和 4 .5 5 % ,其基因型分布符合 Hardy- Weinberg平衡定律。散发性大肠癌和健康人群中两位点的基因频率差异无显著性。结论 APEX基因氧化还原功能区的基因多态性与散发性大肠癌的发生无关。该区多态性分布具有较明显的种族差异。

人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1与卵巢癌的研究进展

人类脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶／氧化还原因子一1（apurinic／apyrimidinicendonuclease／redoxfactor一1，APE／Ref-1）是一个多功能DNA修复蛋白和基因调控蛋白，既有脱嘌呤／脱嘧啶位点（apufinc／apyrimidinicsites，AP位点）核酸内切酶活性，又具调节转录因子的DNA结合活性。

APE1介导的功能核酸生物传感器研究进展

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)是一种广泛存在于生物体内、在碱基切除修复(Base excision repair,BER)过程中能够在碱基缺失位点(AP site)处识别并切割DNA的蛋白酶,其作用效率高且特异性强。同时,APE1在一些癌症细胞中的活性较正常细胞明显偏高,因此其自身也是一种癌症生物标志物。目前,通过在DNA上人工设计AP位点,利用APE1的切割能力生成理想的功能核酸链,并结合不同的信号输出及放大方式,研究者已经建立了一些APE1介导的电化学、荧光功能核酸生物传感技术,实现了对DNA糖基化酶等的酶活性的检测。另外,也有一些针对APE1自身活性的功能核酸生物传感技术被建立起来。综述了近年来APE1介导的功能核酸生物传感技术以及以APE1为靶物质的功能核酸和免疫生物传感技术的研究状况,讨论了与APE1相关的生物传感技术的意义及存在的问题,并对未来利用APE1实现更多靶物质的检测的发展趋势进行了展望,以期促进APE1成为一种功能核酸生物传感技术中常用的酶工具。