假单胞菌TS-1138 L-半胱氨酸脱巯基酶的纯化和性质研究

假单胞菌TS-1138L-半胱氨酸脱巯基酶经DEAECellulose-52阶段洗脱、SephadexG-100柱层析被纯化了80.3倍,SDS-PAGE鉴定为单一条带,该酶的相对分子质量为53.0kDa;酶反应的最适pH为7.5,最适反应温度为35℃,该酶的米氏常数为2.37μmol/L,最大反应速度为0.11μmol/mL·min·Pb2+对该酶有很强的激活作用,Zn2+对该酶有较强的抑制作用,羟胺为该酶特异性的抑制剂.

假单胞菌TS1138 L-半胱氨酸脱巯基酶基因的克隆与表达

提取假单胞菌TS1138染色体基因,以自行设计的引物通过PCR方法扩增得到L-半胱氨酸脱巯基酶基因(cds),将其克隆至克隆载体pBluescript SKⅡ,并转化入大肠杆菌DH5α,测定了含有脱巯基酶基因(cds)的1．2 kb DNA片段的序列；同时,将其克隆至表达载体pETH,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,重组蛋白量占菌体总蛋白的36．8%,经Ni-NTA柱亲合层析后,重组蛋白纯化率达88%以上．用非变性PAGE方法对基因表达的脱巯基酶进行了鉴定．

假单胞菌生物合成L-半胱氨酸途径中脱巯基酶的研究

通过PCR方法扩增得到假单胞菌TS1138L-半胱氨酸脱巯基酶基因(cd),将其克隆至pBluescript SKII载体,测定了含有L-半胱氨酸脱巯基酶基因的1·2kb DNA片段序列,并与其它菌株的脱巯基酶基因进行了同源性比较;同时,将其克隆至表达载体pET-21a(+),IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NTA柱亲合层析后,得到纯化的重组蛋白。利用脱巯基酶的活性染色方法对重组表达的L-半胱氨酸脱巯基酶进行了鉴定,并探讨了L-半胱氨酸脱巯基酶的酶学性质,以及在生物转化合成L-半胱氨酸途径中的关键作用。

利用L-半胱氨酸脱巯基酶拆分DL-半胱氨酸生产D-胱氨酸

利用L-半胱氨酸脱巯基酶实现DL-半胱氨酸的拆分.将前期构建的含有恶臭假单胞菌TS1138菌株的L-半胱氨酸脱巯基酶基因的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-pET21a(+)-CD进行诱导表达,测定其酶活力为126.5 U/g.以该菌体为酶源,考查DL-半胱氨酸拆分条件,确定其最佳pH为9.0,最佳反应温度为45℃,最佳底物浓度6 g/L,最佳菌体浓度为10 g/L,最佳反应时间为1 h.在该条件下拆分DL-半胱氨酸,并将D-半胱氨酸氧化为D-胱氨酸,1 L催化反应体系可获得1.86 g D-胱氨酸,收率为64.6%,经HPLC测定其纯度为98.7%.为D-胱氨酸及D-半胱氨酸提供了一条新的绿色生产途径,具备一定的产业化前景.

假单胞菌酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸

采用微生物酶转化法制备L-半胱氨酸具有周期短、成本低、区域和立体选择性强、反应条件容易控制、环境友好等特点,与传统的毛发水解以及化学合成工艺相比显示出明显的优越性。本文从假单胞菌产酶条件和酶学性质、DL-ATC生物转化途径、固定化细胞转化工艺、基因工程菌的研究、以及L-半胱氨酸脱巯基酶的研究等5个方面介绍了国内外关于生物转化DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)合成L-半胱氨酸的研究进展。

柱前衍生化高效液相色谱法测定酶法拆分的DL半-胱氨酸含量

建立了以1-氟-2,4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺(FDAA)为手性衍生化剂、高效液相色谱法测定半胱氨酸对映异构体含量的方法.采用Inertex-C18色谱柱,以乙腈-水(含0.1%TFA)为流动相进行梯度洗脱,L-半胱氨酸、D-半胱氨酸分别在(2.50～20)mmol/L浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.998 3和0.998 4);其平均回收率分别为100.1%(RSD=0.67%)和99.6%(RSD=0.92%).利用上述方法对重组表达的L-半胱氨酸脱巯基酶拆分DL-半胱氨酸外消旋体混合物进行考察和优化,最终得到纯度为99.5%的D-半胱氨酸,回收率为55.54%.

球形红细菌去除和转化铅的机理研究

通过X-射线衍射光谱分析，球形红细菌（Rhodobacter sphaeroides）H菌株对铅离子的转化产物为硫化铅．H菌株在不同浓度Pb^2＋中培养后，研究了该菌株生长细胞对Ph^2＋去除的动力学和该菌体产生半胱氨酸脱巯基酶活性的变化，用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析了其同工酶谱．结果表明，Pb^2＋浓度为25—150mg·L^-1时，去除速率常数k较大，半衰期T1／2较短，去除率较高；Pb^2＋浓度为75、100和150mg·L^-1时，对H菌株产生半胱氨酸脱巯基酶活力有明显的促进作用，Ph^2＋浓度为200mg·L^-1时，对该酶活力有抑制作用．该菌体细胞及亚细胞组分中铅含量测定结果显示。94％的Ph^2＋分布于细胞壁和细胞质内，仅少量存在于细胞膜上，并结合透射电镜观察和红外光谱分析，证明了该H菌株对船离子去除和转化是在细胞质内进行的．

沼泽红假单胞菌去除铅的实验研究

采用沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)N菌株进行了去除铅的研究。考查pH、温度、接种量、供氧光照条件等因素对其生长及去除铅的影响。结果表明:菌株生长及去除Pb2+的最优条件是pH为7、厌氧光照、温度为30℃,接种量为0.6g·L-1,Pb2+的去除率可达95%以上;模拟了N菌株去除不同浓度Pb2+的动力学方程。进一步研究不同浓度Pb2+对N菌株细胞中半胱氨酸脱巯基酶比活力的影响,结果显示:Pb2+浓度分别为50,100,150mg·L-1时,可提高半胱氨酸脱巯基酶的活力,而当Pb2+浓度提高到200mg·L-1时则抑制其活力。

基于CRISPR/Cas9技术的大白菜内源硫化氢生成酶LCD基因突变体构建

硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是植物细胞内源信号分子,对植物的生长、发育和抗逆性具有重要的调节作用。L-半胱氨酸脱巯基酶(L-cysteine desulfydrase, LCD)是合成内源H2S的关键酶。大白菜(Brassica campestris)是我国北方主要的蔬菜。为研究H2S信号在大白菜中的生理作用,并为育种工作提供新材料,该研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对白菜LCD基因进行了敲除。利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化法将基因编辑载体pYAO-LCD成功转化大白菜"中白60",获得基因编辑的遗传转化植株4株。DNA测序表明,基因编辑后植株在靶标位点的碱基发生了相应的基因编辑。基因编辑植株中内源H2S含量有不同程度的降低。

2株海洋细菌对镉的吸附作用

用高质量浓度镉培养液单独和联合培养2株海洋细菌J2和J6,3、7、10、14、17d后,采用原子吸收法分别测定培养液上清液和菌细胞中Cd2+的质量浓度,以确定2株菌对镉的吸附性能;通过测定菌体细胞内半胱氨酸脱巯基酶的活性,初步研究了2株菌对镉的转化作用机理。试验结果表明,2株菌均可将细胞外的Cd2+吸收到细胞内,在培养至第7d时,上清液中Cd2+的含量达到最低值,随着培养时间的增加逐渐趋于稳定,J2和J6菌体细胞中Cd2+的含量分别在培养到第10d和14d时达最大值,联合培养对镉的吸附作用优于单独培养;J2和J6在镉处理后细胞内的半胱氨酸脱巯基酶活性均显著增高,提示Cd2+的吸附与细胞内半胱氨酸脱巯基酶作用产生的S2-有关。

北戴河海洋沉积物中L-半胱氨酸脱硫细菌的多样性及其特性

【背景】脱硫细菌对有机硫的脱硫作用在硫的生物地球化学循环以及脱硫工业中都起着重要的作用。【目的】了解海洋沉积物中可分解有机物产生硫化氢的细菌多样性。【方法】对我国北戴河海洋沉积物中可培养的L-半胱氨酸脱硫细菌进行分离与筛选,通过对其16SrRNA基因序列测定与分析,构建系统发育树,并对其脱硫、脱氮能力进行检验。【结果】从海洋沉积物中分离得到97株细菌,从以L-半胱氨酸为硫源的培养基中筛选出62株有机脱硫专一型细菌。根据脱硫细菌的形态及其特征,从中选取12株作为典型代表做进一步分析,它们分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、动性球菌属(Planococcus)和红球菌属(Rhodococcus)。结果表明,这12株细菌均可产生半胱氨酸脱巯基酶,能够将半胱氨酸分解为丙酮酸、硫化氢和氨,即同时具备脱硫与脱氮的能力。其中有5株菌脱硫能力较强,分别属于赖氨酸芽孢杆菌属、动性球菌属和芽孢杆菌属。【结论】海洋沉积物中存在着丰富的L-半胱氨酸脱硫细菌,为进一步研究海洋中硫的生物地球化学循环提供了素材。

NO介导的H_2S合成参与乙烯诱导的拟南芥气孔关闭

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型和突变体为材料,利用激光共聚焦显微技术、实时定量PCR和分光光度法,结合药理学实验,探讨两种气体信号分子硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)和一氧化氮(nitric oxide,NO)在乙烯(ethylene,Eth)调控气孔运动中的相互关系.结果表明,H2S合成抑制剂能明显抑制乙烯诱导的拟南芥气孔关闭;乙烯能够显著增加拟南芥叶片的H2S含量,提高L-/D-半胱氨酸脱巯基酶(磷酸吡哆盐依赖性酶)(L-/D-cysteine desulfhydrase,L-/D-CDes)活性及AtL-CDes和AtD-CDes的转录水平;清除NO可减弱乙烯的诱导效应;乙烯亦可明显诱导Atnoa1突变体叶片H2S的积累,但对Atnia1,nia2突变体没有明显作用;H2S合成抑制剂对乙烯诱导气孔保卫细胞和叶片的NO水平升高以及硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)活性增强没有明显影响,同样乙烯可以诱导Atl-cdes和Atd-cdes突变体保卫细胞NO水平升高,说明H2S和NO均参与乙烯诱导的拟南芥叶片气孔关闭,且NO可能位于H2S上游参与调控这一信号通路.

假单胞菌F12转化DL-ATC产物的鉴定及转化条件的研究

目的:确定假单胞菌F12合成产物是否为L-半胱氨酸,减少生成的L-半胱氨酸的降解,增加转化DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)合成L-半胱氨酸的得率。方法:研究通过高效液相色谱和质谱分析确定产物;在不同反应条件下探索L-半胱氨酸降解情况,找到抑制脱巯基酶降解的因素。结果:通过与L-半胱氨酸标准品比较,液相色谱和质谱结果显示该菌的转化产物为L-半胱氨酸;隔绝空气下L-半胱氨酸降解产生的少量硫化氢对L-半胱氨酸的降解有很强的抑制作用,在此条件下转化DL-ATC合成L-半胱氨酸浓度最高达到46.2 mmol/L,得率由31.6%提高到94%。结论:菌株假单胞菌F12转化DL-ATC产物为L-半胱氨酸,隔绝空气条件下有利于L-半胱氨酸的积累。