5-乙炔基脱氧尿苷质谱标记法量化DNA甲基化和羟甲基化

据Stewart-Morgan KR 2023年1月12日[Nature Cell Biology,2023,25(1):183-193.]报道,丹麦哥本哈根大学健康与医学科学学院诺和诺德基金会蛋白质研究中心(CPR)研究人员开发出一种高度敏感的定量方法,称为5-乙炔基脱氧尿苷质谱标记法(5-ethynyl-deoxyuridine labelling for mass spectrometry,i DEMS),通过EdU标记质谱分离DNA。这是第一次用质谱方法来测量纯化的、复制的DNA上的DNA修饰。

广枣中一种胸腺嘧啶脱氧尿苷的分离与鉴定

目的 :研究广枣 (Choerospondiasaxillaxi(Roxb )BurttetHill的果实 )的化学成分。方法 :大孔吸附树脂柱及硅胶柱分离。元素分析和波谱技术结构鉴定。结果 :从广枣 70 %乙醇提取物中分离出一个胸腺嘧啶脱氧尿苷类化合物 ,结构为 5 -甲基-3′ ,5′-二氧-(对氯苯甲酰基 )-2′-脱氧尿苷。结论

2′,3′-双脱氧尿苷的合成

以价廉易得的尿苷为原料,经原甲酸三甲酯选择性地保护2′和3′位的羟基,得到的2′,3′-O-甲氧甲叉尿苷与乙酰溴反应制得溴代核苷衍生物,再经脱溴、脱乙酰氧基成烯,催化氢化还原,碱性条件下醇解得到2′,3′-双脱氧尿苷.

5(6)-羧基荧光素标记2′-脱氧尿苷的合成

以5-碘-2'-脱氧尿嘧啶为起始原料,5(6)-羧基荧光素为荧光标记物,经6步反应合成了5(6)-羧基荧光素标记的2′-脱氧尿苷,并利用高效液相色谱(HPLC),1HNMR和13CNMR对目标化合物的纯度和结构进行了表征.

溴脱氧尿苷标记滞留细胞表达干细胞标记物神经巢蛋白

背景:干细胞和某些种类的肿瘤细胞都存在永生化DNA链的不对称分裂现象,具有自我更新长期存活以及相对无限增殖等特征,这些生物学特性为它们多重变异累积提供潜在的可能性。溴脱氧尿苷能够在细胞代谢过程中掺入到DNA双链中,可以观察标记物长期存在状况。目的:拟应用免疫荧光双染法观察C6胶质瘤细胞中的溴脱氧尿苷标记滞留细胞是否表达干细胞标记物神经巢蛋白。设计、时间及地点:观察对比细胞学实验,于2006-01/2007-02在哈尔滨医科大学第一临床附属医院神经外科研究所完成。材料:Wistar大鼠由哈尔滨医科大学第一临床医院实验动物室提供,C6胶质瘤细胞由哈尔滨医科大学第一临床医院神经外科研究所提供。方法:C6胶质瘤细胞处于指数生长期时加入溴脱氧尿苷,细胞培养2d后更换不含溴脱氧尿苷的细胞培养液。分别在不同时间点用免疫荧光法测定溴脱氧尿苷阳性细胞数目变化,确定溴脱氧尿苷在肿瘤细胞中的标记滞留时间,同时用免疫荧光双染法检测这些溴脱氧尿苷标记滞留细胞是否能够表达干细胞标记物神经巢蛋白。主要观察指标:C6细胞中溴脱氧尿苷免疫荧光染色细胞随时间变化的情况,溴脱氧尿苷-神经巢蛋白免疫荧光双染色细胞数目。结果:细胞指数生长期时溴脱氧尿苷的标记阳性率达97%以上,溴脱氧尿苷标记结束之后,随着时间的延长,阳性细胞数目逐渐减少,到第12天,仅残留少量阳性细胞,数目占细胞总数的1.77%,随后的一两天阳性细胞几乎无法测出。溴脱氧尿苷标记后第12天,溴脱氧尿苷标记滞留的阳性细胞神经巢蛋白染色也为阳性,阳性率为1.61%。结论:C6胶质瘤细胞中的溴脱氧尿苷标记滞留时间为12d,溴脱氧尿苷标记滞留细胞能够表达神经巢蛋白。

5-炔基-2′-脱氧尿苷的合成及其对掺入到寡核苷酸中的影响

目的为寻找具有较好反义活性的药物 ,设计并合成了一类 2′ 脱氧尿苷 5 位修饰的寡核苷酸。方法以 5′ O (4,4′ 二甲氧三苯甲基 )脱氧碘苷为起始原料 (Ⅰ ) ,用双 (三苯基膦 )氯化钯和碘化亚铜偶合末端炔烃 ,得到一系列相应的 5 炔基脱氧尿苷 (Ⅱ )。化合物Ⅱ的 3′ 位经 (2 氰乙基N ,N 二异丙基 )氯化亚磷酰胺缩合后 ,应用标准固相DNA合成法掺入到寡核苷酸中。结果共合成了 4条 2′ 脱氧尿苷 5 位带炔基修饰的寡核苷酸 ,考察了它们的杂交性质 ,测定了与互补DNA的解链温度Tm 值。结论此类修饰的寡核苷酸与对照的天然寡核苷酸杂交亲和力有一定的提高 ,其中丙炔基修饰的寡核苷酸解链温度Tm 值上升约 2 2℃。

影响5-溴脱氧尿苷杀伤油菜种子的几个因素分析

用５－溴脱氧苷（ＢＵｄＲ）处理甘蓝型油菜中油８２１种子，结果表明，ＢＵｄＲ能有效地杀伤油菜种子。在２８℃条件下，用浓度为０．９７３ｍｇ／ｍｌ处理露白的种子，其死亡率可达１０％。

家兔静脉注射5-氟脱氧尿苷的药代动力学

6只新西兰兔耳静脉注射5-氟脱氧尿苷25mg/kg 后2 min,血清5-氟脱氧尿苷浓度达53.4±11.8μg/ml.5-氟脱氧尿苷的体内过程属二室开放模型,其 T_(1/2)α为1.6±0.4min,T_(1/2)β为20±4 min。给药后2min的血样中即检测到5-氟脱氧尿苷的代谢物5-氟尿嘧啶,血清5-氟尿嘧啶浓度达10.0±5.2μg/ml。5-氟尿嘧啶的体内过程亦属二室开放模型,T_(1/2)α为2.2±0.5min,T_(1/2)β为41±19 min。以上结果显示,5-氟脱氧尿苷在兔体内迅速代谢生成5-氟尿嘧啶。5-氟脱氧尿苷在兔体内的消除速度比其代谢物5-氟尿嘧啶快。

溴脱氧尿苷免疫细胞化学法观察豚鼠壶腹上皮细胞的修复过程

为观察给予庆大霉素后豚鼠在体椭圆囊壶腹嵴感觉细胞损伤后的恢复情况，实验组动物２５只连续１０～１４天注射１２５ｍｇ／ｋｇ庆大霉素。给药后的第１、３、７、１４、２２天处死各组动物，分别于处死前６小时给予动物腹腔内注射１５０ｍｇ／ｋｇ的５′－溴－２－脱氧尿苷（Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ，ＢｒｄＵ）。取一侧内耳的壶腹进行连续半薄切片的观察，另一侧壶腹进行免疫细胞化学方法观察。结果显示：损伤后的豚鼠壶腹嵴上皮细胞可以进行有丝分裂。

5—溴脱氧尿苷标记检测细胞增殖活性方法的建立和应用

目前，用５－溴脱氧尿苷标记法检测细胞增殖活性国内尚未见报道，据此，本实验室结合研究课题需要，建立了５－溴脱氧尿苷标记检测细胞增殖活性的免疫细胞化学方法，探讨了测定细胞增殖活性的几种主要影响因素，并在此基础上用于检测Ｓ期肥大细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３成纤维细胞，获得满意结果，作者认为，与其它检测细胞增殖活性的方法，如＾３Ｈ－ＴｄＲ渗入法比较，５－溴脱氧尿苷标记法简便快速可靠，值得在实验室和临床推广使用。

2'-脱氧尿苷的合成工艺改进

以尿苷为原料,经丙酰溴酰化保护的同时溴化得到2'-溴代-3',5'-O-二丙酰基尿苷,再由甲酸铵-Pd/C催化氢转移脱溴氢解,最后氨气皂化制备得到2'-脱氧尿苷,总收率73.4%。

溴脱氧尿苷免疫细胞化学方法显示鸡内耳毛细胞增殖活动

建立溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,BrdU)免疫细胞化学方法显示增殖细咆.按100mg/kg剂量给鸡腹腔注射DNA合成的前体物质BrdU,6h后处死动物,取小肠组织制备石蜡切片,通过免疫细胞化学方法,成功地显示了小肠上皮细胞中的S期增殖细胞,将此法用于观察鸡内耳感觉上皮细胞的生理性再生状态,结果发现鸡前庭感觉上皮中存在着低水平的增殖活动。BrdU免疫细胞化学方法省时,无需特别防护,且定位准确,是显示增殖细胞的理想方法。

混合溶剂体系中牛肝β-半乳糖苷酶催化5-氟-2'-脱氧尿苷区域选择性半乳糖基化反应

研究了混合溶剂体系中有机溶剂种类和含量对牛肝β-半乳糖苷酶催化5-氟-2'-脱氧尿苷区域选择性半乳糖基化反应的影响.结果表明,在含10%(体积分数)有机溶剂体系中,该酶稳定性差,失活严重.减少有机溶剂含量可显著减轻其对该酶的毒害作用.然而,有机溶剂的添加对酶促糖基化反应的区域选择性的影响很小(均保持在99%以上).牛肝β-半乳糖苷酶在混合溶剂体系中的催化性能与有机溶剂的介电常数有良好的相关性,其中在含二甲亚砜(DMSO)体系中该酶催化活性最高.当体系中DMSO含量≤5%时,目标产物收率达71%.

2′-氨基-2′-脱氧尿苷的合成

通过一种简便有效的合成方法对天然核苷进行修饰,制备了重要的生化中间体2′-氨基2′-脱氧尿苷。经紫外、红外、光谱,核磁共振等分析确认其结构和特征。

2',3'-双脱氧尿苷的液相色谱分析方法研究

采用高效液相色谱法测定2',3'-双脱氧鸟苷,使用C18不锈钢柱和紫外可变波长检测器.以甲醇-水为流动相,流动相比例为:V(甲醇)∶V(水)=80∶20;水相比例为0.1 M三乙基乙酸铵的缓冲溶液,流量:1.0 mL/min.用外标法对2',3'-双脱氧尿苷进行分析测定。2',3'-双脱氧尿苷的含量为97.4%,标准偏差为0.167%,变异系数为0.17%,平均回收率为98.8%。

2',3'-双脱氧尿苷合成的新方法

通过用乙酸酐保护2',3'-O-甲氧甲叉尿苷分子上的羟基得到2,2'-脱水-1-(3',5'-双-O-乙酰基-β-D-阿拉呋喃糖基)尿嘧啶,接着以它为关键中间体与乙酰溴作用得到溴代核苷衍生物,在经过脱溴、脱酰氧基成烯,催化氢化还原,碱性条件下醇解得到2',3'-双脱氧尿苷。

5溴脱氧尿苷和端粒酶逆转录酶标记肺干细胞在新生鼠高氧肺损伤中的作用

目的探讨5溴脱氧尿苷(B rdu)和端粒酶逆转录酶(TERT)标记肺干细胞特点及其增殖、分化在肺发育和高氧肺损伤修复中的作用。方法(1)3 d新生鼠分为高氧组(95%左右氧气7 d)、高氧组siRNA干预组(高氧同时TGF-β1 siRNA经腹腔注入,隔日1次,共3次)和正常对照组,处死前自腹腔注入B rdu。(2)免疫组化法检测B rdu和TERT阳性显色细胞,并分别使用碱性磷酸酶和辣根过氧化氢酶两种显色系统作B rdu/TERT和SPC抗体免疫双染。(3)分离新处死肺细胞,立即涂片,做B rdu和TERT免疫标记,计数阳性细胞百分比。结果(1)高氧组可见肺泡壁较薄、结构简单化、肺泡大小不均,有些肺泡融合、体积增加,肺泡腔有较多脱落的AEC II。(2)肺组织B rdu阳性显色部位主要在各级支气管黏膜下和肺间隔,支气管黏膜上皮及肺泡壁有散在分布,阳性细胞数量较少,多呈立方形、核大;TERT阳性显色在外周肺组织肺间隔和肺泡壁部位,数量明显少于B rdu[表达积分(1.61±0.83)vs.(0.62±0.55),P<0.05],且阳性显色呈不对称性,即多集中在肺某一区域;高氧肺组织B rdu和TERT阳性标记细胞稍高于正常对照组[(1.43±0.85)vs.(1.61±0.83);(0.62±0.55)vs.(0.83±0.84),P>0.05]。(3)SPC分别和B rdu、TERT双染,可见少量阳性细胞。(4)肺细胞SPC免疫显色部位在胞浆,呈棕褐色,阳性细胞大小不一,高氧组和正常组显色细胞数无明显区别,阳性细胞百分比分别为80.3%、78.6%。(5)肺细胞B rdu阳性显色细胞明显少于SPC阳性细胞,体积明显大于未显色细胞,核形态主要为致密圆形,个别呈杆状;高氧组阳性细胞数略多于正常组,阳性细胞百分比分别为28.5%、21.4%。(6)TERT阳性显色细胞更为少见,阳性细胞体积多较小,核呈多种形态包括致密圆形、疏松圆形、杆状、分叶状;正常组和高氧组阳性细胞百分比分别为1.5%、2.3%。结论(1)B rdu和TERT可作为不同分化能力的肺干细胞标记,其中TERT更能反映肺干细胞特征或是成体肺干细胞标记更特异性的指标,B rdu标记从干细胞增殖分化尚保留干细胞特征的TAC。(2)高氧肺损伤时肺干细胞出现有限增殖分化。

尿中8-羟基脱氧尿苷及反-反式黏糠酸和苯巯基尿酸测定的液相色谱-质谱法

目的 建立苯作业工人尿中3种生物标志物8-羟基脱氧尿苷、反-反式黏糠酸和苯巯基尿酸同时测定的方法.方法 尿样经固相萃取柱净化后,用液相色谱-质谱仪进行测定,用外标法定量,色谱柱采用C18反相色谱柱,流动相为甲醇与酸性甲酸铵溶液梯度淋洗,质谱采集方式为多反应监测.结果 反-反式粘糠酸测定的线性范围为10～1000μg/L,当添加浓度为50μg/L和500μg/L时,回收率均大于90％,相对标准偏差小于3％；苯巯基尿酸与8-羟基脱氧尿苷测定的线性范围为1～100 μg/L,当添加浓度为5μg/L和50μg/L时,回收率均大于85％,相对标准偏差小于5％.结论 本检测方法各项指标均符合WS/T 68-1996《研制生物样品监测检验方法指南》的要求,适用于尿中苯的3种生物标志物的同时测定.

5溴脱氧尿苷和端粒酶逆转录酶标记肺干细胞在新生鼠高氧肺损伤中的作用

目的探讨5溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,Brdu)和端粒酶逆转录酶(tolomerase re verse transeriptase,TERT)标记肺干细胞特点及其在肺发育和损伤修复中的作用。方法 95％左右氧气7 d制备新生鼠高氧肺损伤模型;将Brdu自腹腔注入模型鼠,免疫组化法检测Brdu和TERT阳性显色细胞,并和表面蛋白C(surfactant protein C,SPC)抗体免疫双染。结果 (1)Brdu阳性显色部位主要在各级支气管黏膜下和肺间隔,支气管黏膜上皮及肺泡壁有散在分布,阳性细胞数量较少,多呈立方形、核大;TERT阳性显色在外周肺组织,肺间隔和肺泡壁部位,数量明显少于Brdu,且阳性显色呈不对称性,即多集中在某一肺叶;(2)SPC阳性显色细胞在肺间隔和肺泡壁,分别和Brdu、TERT双染,可见少量阳性细胞;(3)Brdu、TERT和SPC表达积分在高氧组与正常氧组差异无统计学意义(P>0．05)。 Brdu表达积分无论在高氧组(1．61±0．83)还是正常氧组(1．43±0．85),均高于TERT(分别为0.83± 0．84和0.62±0．55,P<0．05)。结论 Brdu和TERT作为肺干细胞标记,两者各有其特征;肺损伤时Brdu和TERT标记阳性细胞量可提示肺干细胞增殖分化及肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤修复情况。至于 Brdu和TERT哪一个指标更具特异性,是否Brdu同时标记了已从干细胞增殖分化但尚保留干细胞特征的短暂扩增细胞,或TERT更能反映干细胞特征尚待深入研究。

荧光素标记5-溴-4-硫-2′-脱氧尿苷合成及荧光光谱研究

由5-溴-2′-脱氧尿苷通过1,2,4-三唑和硫代乙酸在温和的条件下合成4-硫-5-溴-2′-脱氧尿苷,再通过单溴二胺(monobromobimanes,mBBR)对5-溴-4-硫-2′-脱氧尿苷4位硫的亲电反应,合成了用单溴二胺(monobromobimanes,mBBR)标记的5-溴-4-硫-2′-脱氧尿苷,并利用1HNMR核磁共振、质谱和紫外光谱对它们的结构进行了表征,并对它的荧光光谱进行分析和研究.此化合物可以产生极高的荧光特性,由此提供了一条对人体中5-4-硫-2′-脱氧尿苷的检测途径.