2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶在毕赤酵母中的分泌表达

为实现2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶基因(DERA)在毕赤酵母中分泌表达。通过PCR从E.coli BL21基因组中扩增获得DERA序列,并且与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建得到重组质粒pPIC9K-DERA。重组载体经salⅠ单酶切线性化后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞,用MD/MM平板筛选阳性株并在含G418的YDP培养基中筛选多拷贝插入菌株。经PCR鉴定获得一株插入pPIC9K-DERA的多拷贝嗜甲醇重组毕赤酵母菌株。用甲醇诱导该重组菌株,分泌得到具有活性的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶,且72 h时酶活为2.4 U·mg-1。结果表明,2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶可实现在毕赤酵母中分泌表达。

TBA、ALP、5'-NT、AFU、ADA、CHE、γ-GT、PA水平变化在肝脏疾病患者中的检测价值

分析8项生化指标在肝脏疾病患者中的检测价值。方法 抽取2023年9月-2024年6月我院肝脏疾病患者、健康体检正常者各30例,分析分析检验结果。结果 TBA、ALP、5'-NT、AFU、ADA、γ-GT水平对比,观察组高于对照组,PA、CHE对比,低于对照组(P<0.05),观察5'-NT、TBA、ADA、AFU、ALP、γ-GT指标发现,急性肝炎患者以上指标明显增高,而慢性肝炎主要表现为γ-GT、TBA增高,肝硬化要表现为ADA、TBA、γ-GT、AFU、ALP水平增高,肝硬化患者主要表现为TBA、5'-NT、ADA、γ-GT、AFU增高,PA、CHE水平出现下降。结论 在肝脏疾病患者病情诊断中,可以对TBA、ALP、5'-NT、AFU、ADA、CHE、γ-GT、PA水平进行检测,从而提升患者病情诊断准确性。

改良5'-核苷酸酶-碱性磷酸酶双染色法观察成牙本质细胞层毛细淋巴管

目的:对5'-核苷酸酶-碱性磷酸酶(5'-nucleotidase-alkaline phosphatase,5'-Nase-ALPase)双染色法进行改良,并用其染色观察牙髓成牙本质细胞层是否存在毛细淋巴管。方法:选用牙根发育完成的健康恒前磨牙共44个。首先取15个牙,分为3组,分别用单纯冰冻法、先冰冻后固定法、先固定后冰冻法处理牙髓,选取适用于本研究的标本制备方法。然后取8个牙的牙髓切片对5'-Nase-ALPase双染色法从ALPase反应底物量和反应时间上进行改良。最后取21个牙,其中12例牙髓的切片用改良双染色法染色,9例分3组作对照染色,在光镜下观察成牙本质细胞层中的毛细淋巴管。结果:用改良5'-Nase-ALPase双染色法发现在被染为淡蓝色的成牙本质细胞层中有呈褐色或浅黄色的毛细淋巴管。结论:在牙根发育完成的健康恒前磨牙成牙本质细胞层中有毛细淋巴管。

顺铂致大鼠肾损害与尿5'-核苷酸磷酸二酯酶的关系

目的 :探讨尿 5 '-核苷酸磷酸二酯酶 (5 '- NPD)能否反映顺铂导致的早期肾损害。方法 :采用完全随机设计方法 ,建立顺铂致大鼠肾损害动物模型 ,通过检测顺铂致大鼠肾损害过程中尿 5 '- NPD的活性变化 ,同时用光镜和电镜观察大鼠肾脏的病理改变 ,以验证尿 5 '- NPD能否反映早期肾损害。结果 :实验中空白对照组 (IV组 )和小剂量顺铂组 ( 组 )大鼠的尿5 '- NPD活性以及肾脏病理组织学均无明显改变 ;大剂量顺铂组大鼠 ( 组和 组 )在投药后第 2天 ,尿 5 '- NPD活性开始升高 ,第 4天到达高峰 ,活性明显高于 组和 组 ,而肾脏的病理改变则出现得相对迟缓 ,投药后第 8天可见肾小管中度扩张 ,部分区域有炎性细胞浸润 ;第 15天有较多肾实质细胞坏死。结论 :尿 5 '- NPD指标对顺铂导致的肾损害反映较灵敏 。

3',5'-二磷酸核苷酸酶在亲和双水相胶束系统中分配行为研究

以高分子表面活性剂HM-EO为主成相剂,金属螯合表面活性剂Triton X-114-IDA-Cu(Ⅱ)(TX-Cu(Ⅱ))为辅成相剂,构建新型亲和双水相胶束系统(ATPMS)以提高目标产物的萃取选择性,并考察重组蛋白3',5'-二磷酸核苷酸酶(YND)在系统中分配行为。结果表明,系统中不含亲和配基时YND主要分配于胶束缺失相;随着亲和配基含量的增加,YND与TX-Cu(Ⅱ)亲和结合而逐渐分配到胶束富集相并且在系统中显示出优异的稳定性;调节溶液p H能够影响YND亲和分配,最适萃取条件为pH 9.0;增大无机盐浓度,导致更多杂蛋白分配到胶束缺失相,然而对YND分配影响较小。在2.5%HM-EO、0.125%TX-Cu(Ⅱ)、p H 9.0、50 mmol/L Na Cl条件下,实验获得65.8%的酶活回收率。因此亲和ATPMS可以有效用于对富组氨酸蛋白YND的分离纯化,为该体系在重组蛋白的分离纯化试验提供相应的基础依据。

高效毛细管电泳法测定酱油中5′-单磷酸核苷酸

建立高效毛细管电泳同时分离测定酱油中两种核苷酸鸟嘌呤-5′-单磷酸(GMP)和次黄嘌呤-5′-单磷酸(IMP)的方法。电泳条件:以50μm×60.2cm(有效长度50cm)未涂敷石英毛细管为分离柱,30mmol/L硼砂+30mmol/L碳酸钠+60mmol/L羟丙基-β-环糊精为分离缓冲溶液,50mmol/L醋酸溶液为样品介质,检测波长为254nm。GMP及IMP的校正峰面积与质量浓度在5～100mg/L范围内具有良好线性关系,线性相关系数分别为0.9998和0.9997,检出限均为2mg/L,定量限均为5mg/L。用该法测定了9种酱油,并与文献报道的高效液相色谱法的结果进行比较,结果满意。

HPLC法同时测定人血浆中5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷的浓度

目的:建立一种同时测定人体血浆中5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷浓度的HPLC法。方法:以肌苷为内标,血浆样品用硝酸银(10%)沉淀蛋白质,采用C_(18)柱,检测波长为266nm,流动相:0.01mol·L^(-1)磷酸盐(用2mol·L^(-1)氢氧化钠溶液调pH为7.0)-甲醇(96∶4),流速1.0mL·min^(-1),柱温为45℃。结果:5-氟尿嘧啶和5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷分别在0.1～20μg·mL^(-1)(r=0.9997)和0.2～40μg·mL^(-1)(r=0.9997)浓度范围内线性关系良好,最低检测浓度分别为5和10ng·mL^(-1),方法回收率分别为98.2%～101.2%、99.5%～102.3%,日内、日间RSD均小于6%。结论:方法灵敏、快速、准确,适用于临床上测定5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2′-脱氧尿嘧啶核苷的血药浓度及药动学的研究。

5'-磷酸二酯酶强化香菇风味基料中鲜味成分

研究了5'-磷酸二酯酶强化香菇鲜味成分的工艺条件及其作用.在香菇打浆料中添加5'-磷酸二酯酶及酵母粉,研究各因素对5'-核苷酸产量的影响.结果表明,酵母粉用量、5'-磷酸二酯酶用量、酶解体系pH值、酶解温度及时间等因素对鲜味核苷酸生成有重要影响,正交试验优化的酶解工艺条件为:酵母粉用量5%,5'-磷酸二酯酶用量5%,pH值4.0,酶解温度60℃,酶解时间60min.在此条件下制备的香菇风味基料中鲜味核苷酸(5'-IMP、5'-GMP)产量达到30.01 mg/g,较未经5'-磷酸二酯酶处理基料的鲜味核苷酸产量提高了3倍.

5’-核苷酸酶-碱性磷酸酶双染色法在淋巴管研究中的应用

应用5＇-核苷酸酶-碱性磷酸酶(5＇-Nase-ALPase)双重染色法观察了家兔、豚鼠和Wistar大鼠多个器官的淋巴管和血管.在光镜下见到淋巴管壁呈5＇-Nase阳性反应,显示褐色;而血管壁呈ALPase阳性反应。

香菇乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶编码基因le-pyrG的克隆

通过巢式简并PCR和基因组步行技术从香菇(Lentinula edodes)单核体中克隆到乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶(orotidine-5’-monophosphate decarboxylase,OMPDC)的编码基因le-pyrG,长度为946bp。经生物信息学分析,香菇le-pyrG基因含有2个长度分别为67bp和51bp的内含子,该基因可以编码1个含有275个氨基酸残基的蛋白质序列,该序列经比对分析显示与裂褶菌(Schizophyllum commne)和灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)OMPDC序列的相同性分别为73%和70%,相似性分别为84%和83%。这是首次报道从栽培食用真菌中克隆出乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶编码基因的全序列。

2＇-脱氧胞苷-5＇-磷酸羟基加合物的分子结构与电子结构

使用密度泛函理论(DFT)的B3LYP/DZP++研究了羟基自由基与2′-脱氧胞苷-5′-磷酸(dCMP)的胞嘧啶环加成产物的分子结构与电子结构.结果表明,dCMP胞嘧啶环中各C原子上的单羟基加合物的相对稳定性顺序为C5>C6垌C4≥C2.加合物的稳定性、自旋密度、静电势以及dCMP的电子密度、静电势、电荷分布分析表明,dCMP遭遇多个羟基自由基攻击时,第一个羟基自由基加在dCMP的C5上,而C6则成为第二个羟基自由基的进攻目标.反应中一旦形成了C2-位单羟基加合物,则极有可能在DNA复制过程中引起致命的基因突变,也可能诱发DNA-DNA以及DNA-蛋白质的链间交联,引起更复杂的损伤.相反,C5、C6-位上单羟基加合物的形成对DNA的稳定性不构成直接威胁.

一锅法合成O-(3-薯蓣甙元)-O′-[5′-(3′-叠氮-3′-脱氧胸苷)]-氢亚磷酸酯

Azido-3′-deoxythymidine(AZT) was the first clinically approved drug against HIV infection, despite its undesirable side reactions, such as bone marrow suppression. In our aim to develop new chemical entity of anti-tumor and anti-HIV, the H-phosphonate 6 of AZT conjugate with diosgenin was synthesized by a tandem transesterification reaction for the first time. There are the merits of easy operation and high yield in the reported method. It could be extended to synthesize other diosgenin phosphonate conjugates such as carbohydrate and peptide.

两种3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶的制备及活性测定

3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶[EC.1.4.17](简称PDE),在生物体内有重要的生化功能.它可水解环核苷酸为5'-核苷酸,并与核苷酸环化酶共同维持细胞内环核苷酸水平.根据性质的不同PDE分为多种形式,但总的可分为两大类:依赖于Ca2+的PDE,可被钙调蛋白激活;不依赖于Ca2+的PDE,不被钙调蛋白激活.开展对环核苷酸、钙调蛋白及药物杀虫机理的研究都需要分离制备这两类不同形式的PDE.本实验以新鲜的猪心为材料制备分离出这两种PDE,并进行了活性分析.

2′-脱氧腺苷-5′-磷酸与羟基自由基反应所形成的自由基(英文)

运用可靠的B3LYP/DZP++方法研究了2′-脱氧腺苷-5′-单磷酸(dAMP)与羟基自由基(HO)的反应中所产生的20余种自由基.结果表明,反应的初始产物包括HO加成到dAMP碱基C8、C4位上所形成的羟基加合物自由基,以及dAMP碱基环上氨基的脱氢自由基.而且,反应最初形成的C4位羟基加合物自由基具有脱水产生dAMP碱基环上氨基脱氢自由基的热力学趋势,脱水形成的两种氨基脱氢自由基都是强氧化剂.尽管HO·加成到dAMP碱基C2位上所形成的加成产物比C4位的加成产物更稳定,但dAMP与HO·的氧原子间较强的静电排斥作用却使得HO·难以靠近C2原子,导致C2位的羟基加成产物难以形成.上述结论不但与有关实验结果一致,而且还对一些实验现象作出了合理的解释.

5-炔基-2′-脱氧尿苷的合成及其对掺入到寡核苷酸中的影响

目的为寻找具有较好反义活性的药物 ,设计并合成了一类 2′ 脱氧尿苷 5 位修饰的寡核苷酸。方法以 5′ O (4,4′ 二甲氧三苯甲基 )脱氧碘苷为起始原料 (Ⅰ ) ,用双 (三苯基膦 )氯化钯和碘化亚铜偶合末端炔烃 ,得到一系列相应的 5 炔基脱氧尿苷 (Ⅱ )。化合物Ⅱ的 3′ 位经 (2 氰乙基N ,N 二异丙基 )氯化亚磷酰胺缩合后 ,应用标准固相DNA合成法掺入到寡核苷酸中。结果共合成了 4条 2′ 脱氧尿苷 5 位带炔基修饰的寡核苷酸 ,考察了它们的杂交性质 ,测定了与互补DNA的解链温度Tm 值。结论此类修饰的寡核苷酸与对照的天然寡核苷酸杂交亲和力有一定的提高 ,其中丙炔基修饰的寡核苷酸解链温度Tm 值上升约 2 2℃。

miR-330-5p调控Nox4对缺氧复氧大鼠胚胎心肌细胞损伤影响的实验研究

目的研究miR-330-5p调控烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,Nox4)对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)大鼠胚胎心肌细胞损伤的影响及可能机制。方法将大鼠胚胎心肌细胞H9C2分为对照组(Con)、模型组(H/R)、H/R+anti-miR-NC组、H/R+anti-miR-330-5p组、H/R+pcDNA3.1组、H/R+pcDNA3.1-Nox4组、H/R+anti-miR-330-5p+si-NC组和H/R+anti-miR-330-5p+si-Nox4组。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-330-5p在H/R诱导心肌细胞中的表达;MTT法和流式细胞术检测心肌细胞增殖活力和细胞凋亡;Western blot检测Nox4蛋白及凋亡相关蛋白[细胞周期素D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)、P21]表达;双荧光素酶报告基因实验验证miR-330-5p和Nox4的靶向关系。结果与Con组比较,H/R组细胞中miR-330-5p表达(1.96±0.20 vs1.01±0.11),P21(0.89±0.07 vs 0.21±0.03)和Bax(0.80±0.05 vs 0.18±0.02)蛋白水平及细胞凋亡率(26.67%±2.68%vs 7.22%±0.68%)明显升高(t=7.029,12.591,12.790,12.102),而Cyclin D1(0.20±0.03 vs 0.78±0.06)和Bcl-2(0.11±0.02vs 0.71±0.06)蛋白水平及细胞增殖活性显著降低(t=13.671;11.047;11.333,11.485,12.511),差异具有统计学意义(均P<0.01)。Nox4是miR-330-5p的靶基因,miR-330-5p负调控Nox4表达。抑制miR-330-5p表达或过表达Nox4可促进Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达(t=9.664,7.548),抑制P21和Bax蛋白表达(t=10.184,10.314),增强心肌细胞增殖活力(t=6.667~9.126)、抑制细胞凋亡(t=10.341),差异具有统计学意义(均P<0.01)。抑制Nox4表达能够逆转抑制miR-330-5p对H/R心肌细胞增殖(t=4.146~7.941)和凋亡(t=6.285~11.358)的影响(均P<0.01)。结论H/R诱导的大鼠心肌细胞中miR-330-5p表达上调,抑制miR-330-5p可能通过靶向Nox4抑制心肌细胞凋亡,对H/R大鼠心肌细胞损伤起到保护作用。

大白鼠甲状腺细胞膜系统3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶活性的电镜细胞化学定位

本研究用酶电镜细胞化学法观察了大白鼠甲状腺细胞3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶活性的定位。结果证明,3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶的活性定位于甲状腺滤泡细胞的顶部细胞膜和微绒毛,在内质网则存在于膜的外表面,在甲状腺滤泡细胞核也位于核膜的外表面。在甲状腺滤泡上皮细胞之间的微血管内皮细胞膜上也观察到了大量3′,5′-环核苷酸磷酸二酯酶的阳性反应颗粒。

尿5′-核苷酸磷酸二酯酶的测定方法

目的 :建立一种测定尿 5 ` -核苷酸磷酸二酯酶 (5′- NPD)的新方法 ,试图为临床诊断提供一项检测早期肾损害的生化指标。方法 :以 5′- [5 -碘吲哚酚 - (3) ]胸腺嘧啶核苷酸铵盐作为检测尿 5′-核苷酸磷酸二酯酶的底物 ,在 p H9.0缓冲体系中进行酶促反应后 ,在波长 A5 80 nm下测定尿 5′- NPD的吸光度 (OD)值。结果 :该法重复性 :cv =1.98% ;尿5′- NPD酶活力与 OD值的线性关系 :Y=4.116 X+0 .0 2 76 ,r =0 .993.用该法分别检测 30例肾病患者和 5 0例正常人的尿 5′- NPD,肾病患者的尿 5′- NPD酶活力明显高于正常人 (P <0 .0 1)。结论 :提示尿 5′-