旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族的筛选和分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性基因N5cDNA作为探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行筛选,并将阳性克隆全部送测序公司测序。对测序结果进行序列分析后,根据信号肽不同分为15种基因。NCBI BLAST检索表明,其中有13种基因均为旋毛虫未知基因序列,并且氨基酸序列最前面均包含有1个信号肽,属于分泌性蛋白。InterProScan检索表明,15种氨基酸序列均编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ（DNaseⅡ）,均含有DNaseⅡ的保守序列。通过互联网将编码蛋白序列输入CLUSTAL W数据库,检索结果表明,这些编码的脱氧核糖核酸酶Ⅱ蛋白质同源性高达85%-98%。

桃Ⅱ型NADH脱氢酶家族基因鉴定和表达分析

Ⅱ型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(TypeⅡNADH dehydrogenase)在所有已全基因组测序的植物中均存在,具有多种功能,尤其在大多数植物呼吸链中起重要作用。本研究对桃Ⅱ型NADH脱氢酶家族基因进行了鉴定,确定了桃Ⅱ型NADH脱氢酶基因家族成员数目、亚家族分类,并分别进行了克隆,同时分析了它的进化关系、在基因组骨架上分布、启动子区域、基因结构、不同组织表达水平及其编码的蛋白质结构。结果显示,桃Ⅱ型NADH脱氢酶基因家族共有6个成员,分布在3~6号染色体上,被分为3个亚家族:NDA、NDB、NDC。桃Ⅱ型NADH脱氢酶家族成员,脂肪族氨基酸指数范围是80.63~95.75,等电点预测结果表明Prupe.3G231400.1和Prupe.5G076700.1是酸性蛋白质,其余4个是碱性蛋白质;NDA和NDC亚家族成员二级结构均以无规则卷曲为主要构成元件,NDB亚家族成员二级结构均以α-螺旋为主要构成元件。Ⅱ型NADH脱氢酶家族基因在桃不同组织中的表达水平差异较大,5个基因在老叶中表达量相对较高,在成熟果肉中表达量低。这些结果为下一步进行Ⅱ型NADH脱氢酶基因功能验证奠定了重要基础。

小鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱα融合基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的原核表达LHRH-TAT-DNaseⅡα融合基因(LTD),并制备多克隆抗体。方法采用PCR法克隆LTD基因片段,插入p ET-28a载体,构建重组原核表达质粒p ET-28a-LTD,转化大肠埃希菌BL21(Rossetta),经IPTG诱导表达。融合蛋白经电洗脱分离纯化后,免疫獭兔,制备LTD蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗血清效价。结果构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;纯化得到的融合蛋白相对分子质量为39 270,浓度为0.5 mg/ml,可被兔抗LTD抗体识别。血清抗体效价可达1∶6 400。结论成功原核表达了DNaseⅡ融合蛋白LTD,并制备了多克隆抗体,为进一步研究DNaseⅡ蛋白体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础。

旋毛虫新生幼虫期特异性基因N10的表达及鉴定

根据旋毛虫新生幼虫期特异性基因pBK-CMV-N10序列设计引物,利用PCR技术将基因N10的信号肽去除后,用T/A法克隆到pMD-18T载体,转化至大肠杆菌NovaBlue,经鉴定及序列测定,结果显示成功克隆到N10基因。将重组质粒pMD-18T-N10进行酶切后连接到原核表达载体pET-28a中,重组质粒经鉴定后转化大肠杆菌BL21star(DE3),用IPTG诱导表达出与理论相符的融合蛋白,相对分子质量为38700,诱导4h的表达量占菌体总蛋白量的15%。从N10重组蛋白提取可溶性融合蛋白,对其生物学特性初步鉴定结果表明,具有类似脱氧核糖核酸酶的活性。