HPLC测定脱氧核苷酸钠的含量和有关物质

目的 HPLC测定脱氧核苷酸钠的含量和有关物质方法的建立。方法色谱柱为Agilent Zorbax SAX(4.6mm×250mm,5μm),流动相为0.05 mol.L-1磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.80 g加水800mL,用磷酸调节pH值至3.3,加水稀释至1000mL),流速0.5 mL.min-1,检测波长258 nm。结果脱氧核苷酸钠中脱氧胞嘧啶核苷酸(d-CMP)、脱氧腺嘌呤核苷酸(d-AMP)、脱氧胸腺嘧啶核苷酸(d-TMP)、脱氧鸟嘌呤核苷酸(d-GMP)4种单核苷酸的进样量分别在0.017 6～3.382 7μg、0.019 6～3.758 0μg、0.014 8～2.847 7μg和0.018 0～3.452 8μg内与峰面积线性关系良好(r均为1.000);d-CMP、d-AMP、d-TMP、d-GMP的平均回收率分别为96.73%,97.51%,97.98%,98.39%;RSD分别为0.17%,0.39%,1.32%,0.32%(n=9);精密度、重复性良好。结论采用本方法主峰与杂质峰的分离度好,结果准确可靠,灵敏度高,为本品质量标准的修订和提高提供了基础。

正源负源比较液质联用测定酶解液中脱氧核苷酸含量

目的:建立一种快速灵敏的同时测定DNA酶解液中5′-腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、5′-胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dT-MP)、5′-鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)、5′-胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)的超高效液相色谱质谱(UPLC-MS)方法。方法:采用UPLC-MS色谱质谱系统,安捷伦ZORBAXSBAq-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);以20mmol.L-1醋酸铵缓冲盐溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱(0～10min,B相从5%→10%;10～11min,B相从10%→90%;11～15min,B相为90%;15～16min,B相从90%→5%;16～18min,B相为5%),流速0.6mL·min-1;在电喷雾正离子模式下,采用多反应监测模式(MRM)选择性监测5′-腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)(m/z332.1/81.1和332.1/136.2)、5′-胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)(m/z323.1/81.1和323.1/207.2)、5′-鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)(m/z348.1/152.1348.1/313.3)和5′-胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)(m/z308.1/81.1和308.1/112.1)。结果:5′-腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、5′-胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)、5′-鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)和5′-胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)的线性范围分别为34.8～1160.0ng.mL-1(r=0.9997),32.8～820.0ng.mL-1(r=0.9997),60.0～1200.0ng.mL-1(r=0.9990),37.6～940.0ng.mL-1(r=0.9998),检出限分别为9.4,8.48,11.43,10.35ng·mL-1;定量限分别为31.35,28.28,38.10,34.50ng·mL-1;样品加标回收率为71.1%～117.2%;日内、日间精密度试验的RSD为0.94%～4.99%。结论:该方法快捷,灵敏度高,专一性强,重复性好,可用于DNA酶解液中4种脱氧核苷酸的分析。