脱氧腺苷钴胺素生物合成途径中一种中间产物的研究

在费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)发酵生产维生素B12的研究中,分离到脱氧腺苷钴胺素合成途径中一种关键而稳定的中间产物。该物质在维生素B12发酵过程中大量积累,当添加前体物质5,6-二甲基苯并咪唑(DMB)后可完全转化为脱氧腺苷钴胺素,光谱和质谱分析其应是脱氧腺苷钴胺素合成途径的中间产物——腺苷钴啉醇酰胺。对此中间产物的研究可深入了解厌氧合成脱氧腺苷钴胺素的代谢途径,并运用代谢调控手段优化工艺,指导厌氧发酵生产维生素B12的生产实践。

丙酸对费氏丙酸杆菌生长及脱氧腺苷钴胺素合成的影响

通过添加控制丙酸浓度考查了费氏丙酸杆菌发酵生产VB12的过程中丙酸抑制细胞生长的浓度范围,在此基础上利用树脂对发酵过程中丙酸进行了选择性吸附后细胞的生长和脱氧腺苷钴胺素合成的变化。研究结果表明,丙酸的浓度在10.0g/L时,对菌体细胞生长产生了明显的抑制。在丙酸浓度积累到10.0g/L之前,利用树脂对其吸附分离出2.5g/L的丙酸后,生物量提高了37.5%,脱氧腺苷钴胺素产量提高了50.0%。该实验为实现丙酸的在线分离和丙酸/VB12高效联产的新型耦合发酵工艺提供了基础。

5,6-二甲基苯并咪唑(DMB)对丙酸杆菌生长及合成脱氧腺苷钴胺素的影响

在丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)厌氧发酵生产脱氧腺苷钴胺素(deoxyadenosylcobalamin,简称ADO)的过程中,中间体腺苷钴啉醇酰胺(adenosylcobinamide,简称CBI)和5,6-二甲基苯并咪唑(DMB)结合后生成产物ADO。目前维生素B12脱氧腺苷钴胺素发酵过程中的实时在线检测方法相对匮乏,为了解决该问题,提高维生素B12的发酵单位,以CBI为目标,运用代谢调控方法改善DMB的加入时间,研究不同时间加入DMB对丙酸杆菌生长以及ADO合成的影响。在分批次发酵情况下,实时检测了菌体发酵过程中具体的CBI合成量、ADO产量,并进一步绘制了菌体的生长曲线。结果表明,DMB对丙酸杆菌生长的抑制作用并不明显,但是可以抑制单位菌体产量,发酵周期为120h,最佳添加时间为90～100h,相比60h添加DMB可提高发酵单位59.08%。方法简便、快捷、高效,对维生素B12的发酵调控研究具有一定的参考价值。

HPLC法有效测定发酵液中维生素B_(12)的含量

建立了一种更简便、快速、准确的测定谢氏丙酸杆菌发酵液中脱氧腺苷钴胺素(维生素B12)含量的检测方法,使用高效液相色谱直接检测。利用ApolloC18(5μm,4.6mm×25cm)色谱柱;以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH3.0)作流动相;柱温25℃;检测波长260nm;流速1.0mL/min;恒速洗脱。在所选定的液相色谱条件下,脱氧腺苷钴胺素和杂质分离良好,维生素B12在20μg/mL～80μg/mL范围内线性良好,线性方程相关系数为0.99995,平均回收率为99.92%,相对标准偏差RSD为0.12%。此方法重复性好,样品预处理方法简单,分析速度快,7min内即可实现目的产物和杂质的完全分离。适用于整个发酵过程条件的优化及发酵产物提取过程的监控。

光声量热法测定辅酶B_(12)光解的焓变和体积变化

用时间分辨的光声量热法研究了浦防B12的光解反应，首次测定了脉冲激光诱导输酶B12光解反应的治变和反应体积变化，其值分别为131±12kJ·mol-1和6±1mL·mol-1，推测该反应体积变化可能与Co－C健断裂引起的柔性咕啉环构象变化有关．

大孔树脂吸附法提取羟基钴胺素

比较了8种大孔树脂对费氏丙酸杆菌发酵提取液光解转化后形成的羟基钴胺素的吸附性能,考察了上柱料液pH值对吸附量的影响,分析了不同浓度和pH下乙醇溶液作为洗脱剂的解吸情况,研究了上柱速率对吸附量和解吸率的影响。结果表明,静态实验中,LX-50B型大孔树脂对羟基钴胺素的吸附性能最好,当上柱溶液pH为6时,LX-50B树脂饱和吸附量最高,为203.87mg/g。用pH为2的60%乙醇溶液作洗脱剂时解吸效果最好,羟基钴胺素提取液以2 BV(床柱体积)/h速度上柱吸附饱和,用60%乙醇溶液以0.5 BV/h速度洗脱后,羟基钴胺素浓度提高至1863.32 mg/L,为原提取液浓度的35倍,纯度由0.38%提升至15.73%,提取纯化效果良好。

辅酶B_(12)及其模型化合物

辅酶B12，即5’-脱氧腺苷钴胺素，是一个天然存在的有机金属化合物。它与维生素B12，即氰钴胺素组成和结构相似，但生理功能不同，维生素B12是一种抗恶性贫血的药物，而辅酶B12在生物体内多种代谢过程中起着重要作用。