基于表达元件优化提高脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶DepB在枯草芽孢杆菌中的表达水平

本研究实现了脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶DepB在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RIK 1285中的异源表达,但DepB较低的发酵水平限制了其在食品加工和饲料中的应用,可采用转录和翻译相结合的策略提高DepB在枯草芽孢杆菌中的表达水平。首先,选择9个单启动子替换原始启动子P43,其中单启动子P_(spoVG)介导的重组菌经发酵后酶活力最高,酶活力为29.59 U/mL。其次,选择4个具有较高DepB表达水平的启动子(P43、PsacB、P_(spoVG)和P_(aprE))构建16个双启动子系统,其中,DepB在双启动子P_(aprE^(-))P_(spoVG)的介导下活力达到最高,为48.87 U/mL。此外,通过对启动子P_(aprE^(-))P_(spoVG)的核心区域(-35和-10区)进行优化,Mutant-5酶活力高达69.17 U/mL,是原始菌株(14.45 U/mL)的4.79倍。在此基础上,通过优化启动子P_(spoVG)的核糖体结合位点序列,进一步提高了DepB的表达水平,RBS15酶活力为115.15 U/mL,是原始菌株的7.97倍。研究结果表明,转录和翻译相结合策略是提高重组蛋白发酵水平的有效手段。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是镰刀菌属(Fusariums spp.)产生的剧毒次级代谢产物,主要污染小麦、玉米等粮食及其制品,导致了严重的食品安全风险。目前生物酶法去除DON的技术研究,展现出良好的应用前景。综述了国内外关于DON生物转化的生物酶类型、降解机制、产物结构特征、解毒酶挖掘策略,以及解毒酶分子改造等研究现状,并对人工智能应用于真菌毒素解毒酶的相关研究进行了展望,以期为食品和饲料中DON的生物脱毒技术的研发提供参考。

免疫亲和层析高效液相色谱法对小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定

目的:建立测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的免疫亲和层析高效液相色谱法。方法:小麦粉经粉碎处理,用水提取,通过免疫亲和柱上样、净化和洗脱后,用高效液相色谱仪测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。结果:在100~5 000 ng·mL^(-1),方法的线性关系良好,相关系数(R^(2))为0.999 8,检出限为48 ng·mL^(-1),回收率为90.1%~109.6%,相对标准偏差为1.49%~2.20%。结论:该方法操作步骤简便,特异性强,精密度高,可以作为大批量分析小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的处理方案。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测方法比较与分析

目的:比较胶体金快速检测法、ELISA检测法、高效液相色谱检测法各自技术特点和优劣。方法:通过对玉米样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测数据的对比分析、试验要求条件对比来诠释胶体金快速检测法、ELISA检测法、高效液相色谱检测法各自技术特点。结果:胶体金快速检测法、ELISA检测法、高效液相色谱检测法对比同一样品检测结果存有差异,样品复测稳定性存有差异。结论:胶体金快速检测法可为高效液相色谱法的检测做前期筛查,ELISA法可以作为大量试验样品前期筛查使用,高效液相色谱法可作为方法比对的基准方法或仲裁方法。

响应面法优化禾谷镰刀菌产脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物的液体培养条件

为研究不同液体培养条件对禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol,15-ADON)产量的影响,采用单因素试验和响应面法进行研究。结果表明,培养时间、pH及两者间交互作用对DON产量影响极显著;培养时间及培养时间与培养温度的交互作用对15-ADON产量影响极显著。DON的最佳产毒条件为:培养温度26.3℃,初始pH 6.35,培养22 d,此条件下DON的产量达5739.69μg·L^(-1);15-ADON的最佳产毒条件为:培养温度26.3℃,初始pH 5.58,培养21 d,此条件下15-ADON的产量达10453.41μg·L^(-1),为DON及15-ADON的生物合成、日常监管和污染防控等提供理论依据和数据支持。

不同贮藏条件及加工处理后大麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇膳食风险评估

为探究不同贮藏条件及不同加工处理方式的大麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)膳食摄入风险,在不同温度(5、15、25、35℃)、相对湿度(55%、65%、75%、85%)条件下贮藏大麦180、270、360 d,以蒸制、煮制、发酵工艺进行加工后,通过酶联免疫法检测其DON含量,以点评估与概率评估法探究慢性与急性膳食DON摄入风险。结果表明,初始大麦中DON的每日估计摄入量为0.00030~0.00130 mg/kg、慢性风险评价指数为0.30~1.31,经过360 d贮藏后慢性风险评价指数最高增加0.63,对于食用人群存在32.7%的暴露风险,而国家估计短期摄入量为0.0026~0.0055 mg/kg,急性风险评价指数为0.33~0.69,不存在急性暴露风险。经过加工处理后,慢性风险评价指数由0.60~2.60降为0.17~2.34,急性风险评价指数最高可降低0.64。长期贮藏后的大麦中DON暴露量较高,存在一定的健康风险,而经加工处理后可有效降低风险,且儿童暴露风险大于成人,需重点关注。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对猪毒害作用及毒理机制研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)是一种常见的污染粮食、饲料和食品的霉菌毒素,严重影响人和牲畜的健康。猪对DON非常敏感,DON可造成猪拒食、生长抑制、呕吐以及器官损伤、细胞毒性、免疫毒性等毒害作用。本文主要综述了DON对猪的毒害作用、毒理机制以及解毒剂开发等方面的研究进展,尤其关注DON毒理作用的遗传调控研究,旨在为从遗传本质提高猪对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的抵抗力提供更全面的参考。

改进通过式固相萃取柱-超高效液相色谱-串联质谱法测定谷物及制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及衍生物的含量

开发、设计一种改进通过式固相萃取柱,用于谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物的前处理。称取固体样品2.00 g(液体样品5.00 g),加入400μL 1.0 mg·L^(-1)内标混合溶液,振荡混匀,静置30 min,再加入20.0 mL 84%(体积分数)乙腈溶液(液体样品加入15.0 mL乙腈),涡旋振荡20 min,离心5 min。移取约8 mL上清液,用改进通过式固相萃取柱[填料为160 mg C_(18)、300 mg石墨化碳黑、100 mg氨丙基净化剂(NH_(2))和300 mg硅藻土的混合物]处理,取5.0 mL滤液,于40℃氮吹至干后,加入1.0 mL水,超声30 s,涡旋30 s,过0.22μm微孔滤膜。采用超高效液相色谱-串联质谱法测定其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物的含量,内标法定量。结果表明:经改进通过式固相萃取柱处理后,样品溶液澄清透明,并且5种目标物的基质效应减少;5种目标物标准曲线的线性范围为10~2 000μg·L^(-1),检出限为(3S/N)为5.0μg·kg^(-1);对小麦粉、大米、玉米、啤酒、白酒等基质进行3个浓度水平的加标回收试验,回收率为74.6%~106%,测定值的相对标准偏差(n=6)均不大于9.1%;方法用于162份样品分析,小麦粉、玉米、大米、啤酒中均检出脱氧雪腐镰刀菌烯醇,衍生物中仅检出3-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇脱毒方法研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是粮食和饲料中污染广泛的真菌毒素之一,其化学性质稳定,毒性强,严重威胁人类和动物的健康。目前DON脱毒方法主要有物理脱毒法、化学脱毒法和生物脱毒法,其中生物脱毒法具有安全环保、特异性强、解毒效果显著等优点而备受推崇。生物脱毒法主要包括微生物的吸附作用和酶降解方式等。微生物的酶降解作用是通过破坏DON的毒性基团,例如C12,13位脱环氧、C3-OH氧化和C3-OH异构化等,将DON代谢转化为毒性较小甚至无毒的物质。某些种类的乳酸菌、芽孢杆菌、德沃斯氏菌和酵母菌等细菌和真菌都具备降解DON的能力,乳酸菌作为食品级的益生菌,在降解DON和防控食品真菌毒素污染具有广阔的应用前景。本文综述了DON脱毒方法的研究进展,将其优缺点进行分析总结,旨在为防控食品和饲料中DON污染,尤其是微生物对DON脱毒作用的进一步拓展和深入研究提供参考。

线粒体调控在玉米赤霉烯酮与脱氧雪腐镰刀菌烯醇联合染毒诱导仔猪睾丸支持细胞内质网途径凋亡中的作用

本试验旨在研究线粒体在玉米赤霉烯酮(ZEA)与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)联合染毒诱导仔猪睾丸支持细胞(SCs)内质网途径凋亡中的调控作用机制。将对数生长期仔猪SCs分为对照、ZEA+DON、线粒体分裂抑制因子-1(Mdivi-1)和ZEA+DON+Mdivi-14个处理,处理24 h后,采用荧光显微镜观察细胞存活率,采用透射电镜检测细胞超微结构、线粒体及内质网形态变化,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞内质网途径凋亡相关基因蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、活化转录因子4(ATF4)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和真核生物翻译起始因子2α(eIF2α)mRNA相对表达量,并采用蛋白质印迹法(Western blot)检测内质网途径凋亡相关蛋白PERK、ATP4、CHOP和eIF2α蛋白相对表达量。结果表明:1)与ZEA+DON处理相比,添加Mdivi-1可极显著提高细胞存活率(P<0.01),缓解细胞、线粒体及内质网结构损伤。2)与对照处理相比,Mdivi-1处理细胞凋亡率无显著差异(P>0.05),而ZEA+DON处理和ZEA+DON+Mdivi-1处理细胞凋亡率极显著提高(P<0.01);但与ZEA+DON处理相比,ZEA+DON+Mdivi-1处理细胞凋亡率极显著降低(P<0.01)。3)与对照处理相比,ZEA+DON处理和ZEA+DON+Mdivi-1处理PERK、ATF4、CHOP及eIF2αmRNA相对表达量和蛋白相对表达量极显著提高(P<0.01);但与ZEA+DON处理相比,ZEA+DON+Mdivi-1处理PERK、ATF4、CHOP、eIF2αmRNA相对表达量和蛋白相对表达量显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。由此可知,线粒体通过内质网途径在ZEA与DON联合染毒仔猪SCs凋亡中发挥重要作用,干预该过程可为霉菌毒素的生殖毒性危害解除提供新思路。

小麦籽粒中原型及修饰型脱氧雪腐镰刀菌烯醇的产生规律研究

目的研究原型脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)及其修饰型的产生规律。方法以小麦籽粒为培养材料,辐照灭菌后接种禾谷镰刀菌,并分别在不同温度(10、20、30℃)和水活度(0.95、0.98 a_w)下培养不同时间(7、14、21、28、35d)后,运用超高效液相色谱-串联质谱检测DON,3-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-acetyl-deoxynivalenol,3-ADON),15-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyl-deoxynivalenol,15-ADON)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(deoxynivalenol-3-glucoside,D3G)的产量。结果在所有培养条件下,原型DON的产量均随时间延长而增加;并于0.98 a_w, 20℃下的第35 d达到最高值100490.0μg/kg;不同培养条件下,修饰型DON的生成情况各不相同,3-ADON、15-ADON和D3G分别于0.98a_w,20℃下的第14、28和35 d达到各自产量最高值(3-ADON:7583.5μg/kg; 15-ADON:592.0μg/kg; D3G:6806.4μg/kg)。此外, 10℃下,D3G/DON比值随时间延长先增高后降低,而20、30℃下D3G/DON比值随时间延长呈指数下降(r^2>0.90)。结论小麦籽粒中原型和修饰型DON的最适产生条件均为0.98 a_w, 20℃。本研究可为DON及其修饰型的生物合成、日常监管、污染防控等提供理论基础和科学依据。

降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇菌株的筛选与鉴定

本试验旨在筛选能够降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的微生物,应用于DON的脱毒。试验以DON为唯一碳源,从土壤、鸡和猪粪便等样品中筛选可以降解DON的菌株。选取其中降解率最高的菌株,通过细菌形态学、生理生化特征、16S rRNA以及特异性基因gyrB序列测定进行菌株鉴定,并探究其降解DON活性成分,以及DON的降解产物对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)活力和凋亡的影响。结果表明:1)从小麦田土壤样品中分离出了1株能够降解DON(1μg/mL)的菌株,在37℃培养96 h后对DON的降解率为60.77%,经鉴定并命名为解淀粉芽孢杆菌H7(Bacillus amyloliquefaciens H7)。2)解淀粉芽孢杆菌H7菌株主要通过分泌胞外酶降解DON。3)在CCK-8试验中,处理IPEC-J2细胞24和48 h后,0.5和1.0μg/mL DON降解产物组细胞存活率极显著高于DON组(P<0.01);在细胞凋亡试验中,处理IPEC-J2细胞24和48 h后,0.5μg/mL DON降解产物组细胞早期凋亡率和总凋亡率都显著低于DON组(P<0.05)。综上所述,本试验筛选到1株可降解DON的解淀粉芽孢杆菌H7,其活性物质胞外酶主要分布在细菌培养液上清中;DON经降解后对猪小肠上皮细胞的毒性降低。

乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染、毒性及转化研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)俗称呕吐毒素,是禾谷镰刀菌等真菌产生的次级代谢产物,是谷物原料及其制品中最常见的污染物之一。DON的产生往往伴随其主要乙酰化衍生物3-乙酰基-DON和15-乙酰基-DON的产生,这些衍生物表现出与DON相似甚至更强的毒性,因而增加了谷物及其制品的食用安全风险。本文简述了DON乙酰化衍生物的产生、检测技术及污染现状,重点分析了DON乙酰化衍生物的毒性及转化研究进展,以期为粮食中DON乙酰化衍生物的降解和防控研究提供理论参考。

Fe^(3+)掺杂聚多巴胺纳米球荧光适配体传感器对小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测

目的:构建一种基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理的荧光适配体传感器,用于检测小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)。通过掺入Fe^(3+)提高传感器中聚多巴胺纳米球(polydopamine nanospheres,PDANS)对6-羧基荧光素(6-carboxyuorescein,FAM)的猝灭能力。方法:标记有FAM的DON核酸适配体(P_(DON))通过π-π堆积的非共价作用吸附到Fe^(3+)掺杂聚多巴胺纳米球(Fe-PDANS)上,由于FRET,FAM的荧光被Fe-PDANS猝灭。在DON存在的情况下,P_(DON)可以和DON特异性结合,改变P_(DON)的构象,使其难以吸附到Fe-PDANS上,从而增强传感器的荧光信号,实现对DON的检测。结果:该传感器在DON质量浓度0.266 7~133.3 ng/mL范围内具有良好的线性关系,其检出限为0.118 2 ng/mL;同时,对阳性小麦中的DON进行检测,其检测结果与酶联免疫检测法所得结果无显著差异(P>0.05)。结论:所构建的荧光适配体传感器反应快速、灵敏,且具有良好的特异性和重复性,提供了检测小麦中DON的新方法。

仓储小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测技术的优化

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是小麦仓储过程中的重要危害因子,其污染水平是仓储公司定期检测的重要指标。为提高DON检测的平行性和准确度,文章对仓储小麦DON检测过程中样品制备和酶联免疫吸附法(ELISA)检测关键技术进行优化。结果表明:样品制备过程中,将扦样后的样品先粉碎再分样的处理方法(方法 2)明显优于先分样再粉碎的方法(方法 1),测定样品的相对标准偏差由25.28%降至7.42%。另外,将ELISA检测过程中两种不同的移液枪使用方法(前进移液法和反向移液法)进行比较,发现前进移液法在10次测定中结果相对标准偏差较小,平行性较好;且加样过程中,采用不贴壁加样方式会使检测值更加准确,平行性也较好。优化后的仓储小麦中DON毒素ELISA快速检测技术具有较好的平行性和准确度,可用于实际仓储小麦中DON毒素的准确、快速检测。

表面增强拉曼光谱法快速测定小麦表面的脱氧雪腐镰刀菌烯醇

目的基于表面增强拉曼光谱法(surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)建立小麦表面脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)的快速检测方法。方法以银纳米颗粒(silver nanoparticles,AgNPs)为基础,利用其表面修饰的特殊官能团与DON之间的疏水作用,捕获小麦表面附着的DON,然后再以AgNPs作为表面增强拉曼基底材料,在铝箔表面进行自组装并进行SERS检测。结果采用1-硫代硅烷对AgNPs进行修饰,可以更好地捕获DON分子,选择合适浓度的AgNPs在铝箔表面进行自组装就可以实现DON的快速SERS检测。实验结果显示,在DON浓度为3.3~333.0mg/L的范围内具有良好的线性关系。将经过修饰的AgNPs分散到小麦表面,可以捕获附着在其表面的DON,回收率实验显示,在小麦表面DON的添加浓度为12、25和50μg/g时,均可以实现80%以上的回收率。结论本方法操作简单、快速,结合便携式拉曼光谱仪,有望用于小麦表面DON的快速现场检测。

玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇双特异性抗体的制备及检测方法构建

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是粮食中常见的真菌毒素,长期的饮食暴露会对生物体造成严重危害。目前针对ZEN和DON同步免疫检测分别依赖各自对应的单克隆抗体,而传统单克隆抗体制备周期长、成本高。作者利用重组抗体表达技术在短时间内获得了可同时识别ZEN和DON的双特异性抗体(Bis-scFv),并构建了基于Bis-scFv的间接竞争酶联免疫检测方法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,IC-ELISA),获得ZEN和DON标准曲线的半数抑制质量浓度(IC50)分别为20.64 ng/mL和132.29 ng/mL;Bis-scFv具有良好的特异性,与其他真菌毒素均无显著的交叉反应。同时,将IC-ELISA方法对玉米中的ZEN和DON进行加标回收实验,其回收率为86.02%~108.14%。本研究证明了Bis-scFv可用于粮食样本中ZEN与DON的同步快速检测。

超导体包被免疫荧光试纸法同时测定玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮适用性研究

为了能同时快速测定玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)两种毒素,采用基于超导体包被的免疫荧光快速定量检测技术,检测了多个玉米样品,结合加标回收率、稳定性、检出限、精密度等指标,并与液相色谱法的检测结果进行比较分析,评估方法的适用性。结果表明,超导体包被的免疫荧光试纸法检测DON含量在100~2500μg/kg,检测ZEN含量在5~200μg/kg的范围内线性良好。DON在500~2000μg/kg添加水平范围内,回收率为103.72%~108.17%,ZEN在50~150μg/kg添加水平范围内,回收率为97.81%~111.27%。该方法于液相色谱法检测结果对比,DON相对偏差在3.72%~8.17%,ZEN相对偏差在2.19%~11.27%,均低于液相色谱法允许偏差23%和15%,超导体包被的免疫荧光试纸法是一种有效、实用、快速、定量的分析方法,能满足同时检测玉米中DON和ZEN的要求。

上海市市售婴幼儿谷类辅助食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的膳食暴露评估

利用2018~2022年上海市市售婴幼儿谷类辅助食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的风险监测数据,采用点评估法对婴幼儿谷类辅助食品中的DON进行膳食暴露评估。结果表明:在221件婴幼儿谷类辅助食品中DON的检出率为12.2%,平均含量为17.0μg/kg。上海市846名0~36月龄婴幼儿每日婴幼儿谷类辅助食品的食用率为8.6%,且食用人群每日通过婴幼儿谷类辅助食品摄入DON的膳食暴露量平均值和P95值分别为0.048、0.168μg/kg·bw,分别占每日耐受摄入量(TDI)的4.8%和16.8%,总体健康风险较低。

免疫亲和柱净化—高效液相色谱法同时检测小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物

建立脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）及其衍生物3-乙酰基—脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-ADON）和15-乙酰基—脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-A-DON）的免疫亲和柱净化—高效液相色谱同时检测方法。小麦样品经超纯水提取、免疫亲和柱净化、吹干、定容后,用配有紫外检测器的高效液相色谱仪进行DON、3-A-DON和15-A-DON三种毒素的同时检测,并与液相色谱质谱法比对。结果表明：该方法检出限,DON、3-A-DON和15-A-DON均为100μg/kg,样品加标回收率范围86.6%～96.5%,变异系数小于10%,具有较好的准确性和精密度。该方法简单、快速、灵敏度高、选择性好,适用于小麦中DON、3-A-DON和15-A-DON的同时检测。