基于气相色谱-质谱法检测禾谷镰孢菌丝胞内外的脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇

禾谷镰孢(Fusarium graminearum)是引起小麦赤霉病的主要病原真菌,不仅会造成严重的作物减产,还会产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)等真菌毒素污染谷物,威胁人畜健康。为探究禾谷镰孢产毒菌丝胞内外的毒素含量,本文建立了气相色谱-质谱联用法同时检测DON和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON)。通过质谱特征扫描,DON和15-ADON均获得了较高离子化效应的离子。在单离子检测(SIM)模式下,利用m/z295、235和193离子定性分析DON,m/z 392、235和193离子定性分析15-ADON。选择其中响应强度最高的m/z 235离子定量分析DON,m/z 193离子定量分析15-ADON。利用该方法检测禾谷镰孢野生型PH-1和DON合成缺陷突变体tri5胞内外的DON和15-ADON含量,PH-1胞内的DON和15-ADON含量分别为(149.13±9.15)μg/g和(1833.31±185.33)μg/g,胞外含量分别为(5910.35±468.23)μg/g和(45222.12±2726.81)μg/g;tri5突变体的胞内外均未检测到DON和15-ADON。该方法可用于菌丝胞内外DON和15-ADON的同时分析。

同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的不确定度评价

采用同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇,对测定过程中可能引入的不确定度进行分析评定,为建立有效的质量控制方法提供参考。结果表明:小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量为306μg/kg时,其扩展不确定度为59μg/kg(k=2),影响检测结果不确定度的因素主要是标准溶液配制,其次是样品称量和样品基质,而样品提取及定容、标准曲线拟合及测量重复性等引入的不确定度较小。

农产品检测用脱氧雪腐镰刀菌烯醇纯度标准物质的研制

[目的]本文旨在研制脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)国家级纯度标准物质,为农产品中DON的检测等工作提供物质基础。[方法]利用质量平衡法和定量核磁共振法对DON纯度标准物质进行纯度定值。质量平衡法包括采用液相色谱面积归一化法测定DON主成分含量,采用卡尔费休库仑法测定纯度标准物质中水分含量,采用顶空气相色谱-质谱法测定挥发性杂质含量,以及采用电感耦合等离子质谱法测定无机离子杂质含量。定量核磁共振法采用苯甲酸为内标,选择合适的共振峰,内标法定量标准物质的纯度,并对标准物质进行均匀性、稳定性检测和不确定度评估。[结果]质量平衡法的纯度定值结果为99.47%,定量核磁共振法定值结果为99.45%,最终所研制的DON纯度标准物质的纯度为99.5%,扩展不确定度为0.4%,均匀性良好,且满足12个月以上的稳定性要求。[结论]本试验所研制的DON纯度标准物质符合国家标准物质技术规范,目前已被批准为国家一级标准物质,并已被用于小麦、玉米等农产品实际检测过程中。

谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇物理降解研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是谷物及其制品中污染最广泛的真菌毒素之一,严重危害人畜的健康。物理法降解DON具有安全无毒、可操作性强和不易引入其他有害物质等优点,是目前研究最多的降解方法。本综述简单介绍了常用的热处理和非热物理加工技术的降解原理,重点论述了各种物理技术对DON的降解效果以及影响因素,分析并总结了各种方法的优缺点,以期为谷物中DON的物理降解研究提供参考。

基于表达元件优化提高脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶DepB在枯草芽孢杆菌中的表达水平

本研究实现了脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶DepB在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RIK 1285中的异源表达,但DepB较低的发酵水平限制了其在食品加工和饲料中的应用,可采用转录和翻译相结合的策略提高DepB在枯草芽孢杆菌中的表达水平。首先,选择9个单启动子替换原始启动子P43,其中单启动子P_(spoVG)介导的重组菌经发酵后酶活力最高,酶活力为29.59 U/mL。其次,选择4个具有较高DepB表达水平的启动子(P43、PsacB、P_(spoVG)和P_(aprE))构建16个双启动子系统,其中,DepB在双启动子P_(aprE^(-))P_(spoVG)的介导下活力达到最高,为48.87 U/mL。此外,通过对启动子P_(aprE^(-))P_(spoVG)的核心区域(-35和-10区)进行优化,Mutant-5酶活力高达69.17 U/mL,是原始菌株(14.45 U/mL)的4.79倍。在此基础上,通过优化启动子P_(spoVG)的核糖体结合位点序列,进一步提高了DepB的表达水平,RBS15酶活力为115.15 U/mL,是原始菌株的7.97倍。研究结果表明,转录和翻译相结合策略是提高重组蛋白发酵水平的有效手段。

不同疑似赤霉病小麦籽粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮含量监测

采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)建立同时测定小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)含量的方法。以疑似赤霉病小麦籽粒为研究对象,考察在不同储藏条件下DON和ZEN含量的变化情况。结果表明:以乙腈与水(体积比90∶10)作为提取溶剂,样品振荡提取20 min,以乙腈-体积分数0.1%甲酸作为流动相进行梯度洗脱时,DON和ZEN在一定的质量浓度范围内均具有良好的线性关系(r>0.999),方法的检出限为5.0μg/kg,定量限为15.0μg/kg,回收率为90.6%~94.6%,变异系数为1.72%~3.45%。储藏试验结果表明,小麦分别在高温高湿和常温条件下储藏一段时间,其DON和ZEN含量均未发生显著变化,说明DON和ZEN可能主要来源于小麦生长环境中。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇解毒酶研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是镰刀菌属(Fusariums spp.)产生的剧毒次级代谢产物,主要污染小麦、玉米等粮食及其制品,导致了严重的食品安全风险。目前生物酶法去除DON的技术研究,展现出良好的应用前景。综述了国内外关于DON生物转化的生物酶类型、降解机制、产物结构特征、解毒酶挖掘策略,以及解毒酶分子改造等研究现状,并对人工智能应用于真菌毒素解毒酶的相关研究进行了展望,以期为食品和饲料中DON的生物脱毒技术的研发提供参考。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成及降解研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是一种主要污染小麦等禾谷类作物的霉菌毒素,具有较强的毒性,可通过食物链的富集作用对人和动物健康构成严重威胁。本文详细探讨了DON的分子结构、化学性质以及生物合成过程,分析了DON合成的影响因素和降解方法,并针对不同产品的DON污染问题提出相应的解决策略,旨在为有效预防和控制粮食中的DON污染提供理论支撑。

高效液相色谱法测定薏苡仁中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇

目的:构建免疫亲和柱净化与高效液相色谱法相结合以测定薏苡仁中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的方法。方法:薏苡仁经粉碎处理,用水提取,经免疫亲和柱上样、净化和洗脱后,用高效液相色谱仪测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。结果:在40~400 ng·mL^(-1),脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度与峰面积呈良好的线性关系,相关系数为1,检出限为9.6μg·kg^(-1),定量限为28.8μg·kg^(-1),回收率为90.7%~106.2%,相对标准偏差均小于4%。结论:该方法操作步骤简便,专属性强,精密度高,可以作为测定薏苡仁中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的方法。

免疫亲和层析高效液相色谱法对小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定

目的:建立测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的免疫亲和层析高效液相色谱法。方法:小麦粉经粉碎处理,用水提取,通过免疫亲和柱上样、净化和洗脱后,用高效液相色谱仪测定小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量。结果:在100~5 000 ng·mL^(-1),方法的线性关系良好,相关系数(R^(2))为0.999 8,检出限为48 ng·mL^(-1),回收率为90.1%~109.6%,相对标准偏差为1.49%~2.20%。结论:该方法操作步骤简便,特异性强,精密度高,可以作为大批量分析小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的处理方案。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对动物肠道的影响

霉菌毒素是霉菌在生长过程中产生的具有毒副作用的次级代谢产物,在大自然中广泛存在。调查数据显示,全球范围内,每年约有25%的农作物受到不同程度的霉菌毒素污染,有近10万头(只)的畜禽因霉变饲料中毒死亡,约2%的农作物因此失去营养价值与经济效益,其中,DON是常见的霉菌毒素之一。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测方法比较与分析

目的:比较胶体金快速检测法、ELISA检测法、高效液相色谱检测法各自技术特点和优劣。方法:通过对玉米样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测数据的对比分析、试验要求条件对比来诠释胶体金快速检测法、ELISA检测法、高效液相色谱检测法各自技术特点。结果:胶体金快速检测法、ELISA检测法、高效液相色谱检测法对比同一样品检测结果存有差异,样品复测稳定性存有差异。结论:胶体金快速检测法可为高效液相色谱法的检测做前期筛查,ELISA法可以作为大量试验样品前期筛查使用,高效液相色谱法可作为方法比对的基准方法或仲裁方法。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇对猪毒害作用及毒理机制研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)是一种常见的污染粮食、饲料和食品的霉菌毒素,严重影响人和牲畜的健康。猪对DON非常敏感,DON可造成猪拒食、生长抑制、呕吐以及器官损伤、细胞毒性、免疫毒性等毒害作用。本文主要综述了DON对猪的毒害作用、毒理机制以及解毒剂开发等方面的研究进展,尤其关注DON毒理作用的遗传调控研究,旨在为从遗传本质提高猪对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的抵抗力提供更全面的参考。

不同贮藏条件及加工处理后大麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇膳食风险评估

为探究不同贮藏条件及不同加工处理方式的大麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)膳食摄入风险,在不同温度(5、15、25、35℃)、相对湿度(55%、65%、75%、85%)条件下贮藏大麦180、270、360 d,以蒸制、煮制、发酵工艺进行加工后,通过酶联免疫法检测其DON含量,以点评估与概率评估法探究慢性与急性膳食DON摄入风险。结果表明,初始大麦中DON的每日估计摄入量为0.00030~0.00130 mg/kg、慢性风险评价指数为0.30~1.31,经过360 d贮藏后慢性风险评价指数最高增加0.63,对于食用人群存在32.7%的暴露风险,而国家估计短期摄入量为0.0026~0.0055 mg/kg,急性风险评价指数为0.33~0.69,不存在急性暴露风险。经过加工处理后,慢性风险评价指数由0.60~2.60降为0.17~2.34,急性风险评价指数最高可降低0.64。长期贮藏后的大麦中DON暴露量较高,存在一定的健康风险,而经加工处理后可有效降低风险,且儿童暴露风险大于成人,需重点关注。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇脱毒方法研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是粮食和饲料中污染广泛的真菌毒素之一,其化学性质稳定,毒性强,严重威胁人类和动物的健康。目前DON脱毒方法主要有物理脱毒法、化学脱毒法和生物脱毒法,其中生物脱毒法具有安全环保、特异性强、解毒效果显著等优点而备受推崇。生物脱毒法主要包括微生物的吸附作用和酶降解方式等。微生物的酶降解作用是通过破坏DON的毒性基团,例如C12,13位脱环氧、C3-OH氧化和C3-OH异构化等,将DON代谢转化为毒性较小甚至无毒的物质。某些种类的乳酸菌、芽孢杆菌、德沃斯氏菌和酵母菌等细菌和真菌都具备降解DON的能力,乳酸菌作为食品级的益生菌,在降解DON和防控食品真菌毒素污染具有广阔的应用前景。本文综述了DON脱毒方法的研究进展,将其优缺点进行分析总结,旨在为防控食品和饲料中DON污染,尤其是微生物对DON脱毒作用的进一步拓展和深入研究提供参考。

响应面法优化禾谷镰刀菌产脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物的液体培养条件

为研究不同液体培养条件对禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol,15-ADON)产量的影响,采用单因素试验和响应面法进行研究。结果表明,培养时间、pH及两者间交互作用对DON产量影响极显著;培养时间及培养时间与培养温度的交互作用对15-ADON产量影响极显著。DON的最佳产毒条件为:培养温度26.3℃,初始pH 6.35,培养22 d,此条件下DON的产量达5739.69μg·L^(-1);15-ADON的最佳产毒条件为:培养温度26.3℃,初始pH 5.58,培养21 d,此条件下15-ADON的产量达10453.41μg·L^(-1),为DON及15-ADON的生物合成、日常监管和污染防控等提供理论依据和数据支持。

改进通过式固相萃取柱-超高效液相色谱-串联质谱法测定谷物及制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及衍生物的含量

开发、设计一种改进通过式固相萃取柱,用于谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物的前处理。称取固体样品2.00 g(液体样品5.00 g),加入400μL 1.0 mg·L^(-1)内标混合溶液,振荡混匀,静置30 min,再加入20.0 mL 84%(体积分数)乙腈溶液(液体样品加入15.0 mL乙腈),涡旋振荡20 min,离心5 min。移取约8 mL上清液,用改进通过式固相萃取柱[填料为160 mg C_(18)、300 mg石墨化碳黑、100 mg氨丙基净化剂(NH_(2))和300 mg硅藻土的混合物]处理,取5.0 mL滤液,于40℃氮吹至干后,加入1.0 mL水,超声30 s,涡旋30 s,过0.22μm微孔滤膜。采用超高效液相色谱-串联质谱法测定其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其4种衍生物的含量,内标法定量。结果表明:经改进通过式固相萃取柱处理后,样品溶液澄清透明,并且5种目标物的基质效应减少;5种目标物标准曲线的线性范围为10~2 000μg·L^(-1),检出限为(3S/N)为5.0μg·kg^(-1);对小麦粉、大米、玉米、啤酒、白酒等基质进行3个浓度水平的加标回收试验,回收率为74.6%~106%,测定值的相对标准偏差(n=6)均不大于9.1%;方法用于162份样品分析,小麦粉、玉米、大米、啤酒中均检出脱氧雪腐镰刀菌烯醇,衍生物中仅检出3-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇。

仓储小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测技术的优化

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是小麦仓储过程中的重要危害因子,其污染水平是仓储公司定期检测的重要指标。为提高DON检测的平行性和准确度,文章对仓储小麦DON检测过程中样品制备和酶联免疫吸附法(ELISA)检测关键技术进行优化。结果表明:样品制备过程中,将扦样后的样品先粉碎再分样的处理方法(方法 2)明显优于先分样再粉碎的方法(方法 1),测定样品的相对标准偏差由25.28%降至7.42%。另外,将ELISA检测过程中两种不同的移液枪使用方法(前进移液法和反向移液法)进行比较,发现前进移液法在10次测定中结果相对标准偏差较小,平行性较好;且加样过程中,采用不贴壁加样方式会使检测值更加准确,平行性也较好。优化后的仓储小麦中DON毒素ELISA快速检测技术具有较好的平行性和准确度,可用于实际仓储小麦中DON毒素的准确、快速检测。

线粒体调控在玉米赤霉烯酮与脱氧雪腐镰刀菌烯醇联合染毒诱导仔猪睾丸支持细胞内质网途径凋亡中的作用

本试验旨在研究线粒体在玉米赤霉烯酮(ZEA)与脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)联合染毒诱导仔猪睾丸支持细胞(SCs)内质网途径凋亡中的调控作用机制。将对数生长期仔猪SCs分为对照、ZEA+DON、线粒体分裂抑制因子-1(Mdivi-1)和ZEA+DON+Mdivi-14个处理,处理24 h后,采用荧光显微镜观察细胞存活率,采用透射电镜检测细胞超微结构、线粒体及内质网形态变化,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞内质网途径凋亡相关基因蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、活化转录因子4(ATF4)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和真核生物翻译起始因子2α(eIF2α)mRNA相对表达量,并采用蛋白质印迹法(Western blot)检测内质网途径凋亡相关蛋白PERK、ATP4、CHOP和eIF2α蛋白相对表达量。结果表明:1)与ZEA+DON处理相比,添加Mdivi-1可极显著提高细胞存活率(P<0.01),缓解细胞、线粒体及内质网结构损伤。2)与对照处理相比,Mdivi-1处理细胞凋亡率无显著差异(P>0.05),而ZEA+DON处理和ZEA+DON+Mdivi-1处理细胞凋亡率极显著提高(P<0.01);但与ZEA+DON处理相比,ZEA+DON+Mdivi-1处理细胞凋亡率极显著降低(P<0.01)。3)与对照处理相比,ZEA+DON处理和ZEA+DON+Mdivi-1处理PERK、ATF4、CHOP及eIF2αmRNA相对表达量和蛋白相对表达量极显著提高(P<0.01);但与ZEA+DON处理相比,ZEA+DON+Mdivi-1处理PERK、ATF4、CHOP、eIF2αmRNA相对表达量和蛋白相对表达量显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。由此可知,线粒体通过内质网途径在ZEA与DON联合染毒仔猪SCs凋亡中发挥重要作用,干预该过程可为霉菌毒素的生殖毒性危害解除提供新思路。

玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇双特异性抗体的制备及检测方法构建

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)是粮食中常见的真菌毒素,长期的饮食暴露会对生物体造成严重危害。目前针对ZEN和DON同步免疫检测分别依赖各自对应的单克隆抗体,而传统单克隆抗体制备周期长、成本高。作者利用重组抗体表达技术在短时间内获得了可同时识别ZEN和DON的双特异性抗体(Bis-scFv),并构建了基于Bis-scFv的间接竞争酶联免疫检测方法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,IC-ELISA),获得ZEN和DON标准曲线的半数抑制质量浓度(IC50)分别为20.64 ng/mL和132.29 ng/mL;Bis-scFv具有良好的特异性,与其他真菌毒素均无显著的交叉反应。同时,将IC-ELISA方法对玉米中的ZEN和DON进行加标回收实验,其回收率为86.02%~108.14%。本研究证明了Bis-scFv可用于粮食样本中ZEN与DON的同步快速检测。