液相色谱-电感耦合等离子质谱和电喷雾电离质谱研究乙二胺二氯合钯与鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸反应产物

建立了基于HPLC-ICP-MS分离乙二胺二氯合钯[Pd(en)Cl2]与鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸5'-d GMP反应产物的方法。方法得到两种能够随色谱流出的产物,产物在25 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0)作为流动相时,得到的分离峰型良好。主产物保留时间为2.8 min,另一产物保留时间为3.2 min。主产物经富集后由ESI-MS(MS/MS)鉴定得到m/z为510,511,512,514和516的[M+1]+分子离子峰且丰度比与Pd同位素元素一致,再通过碎片推断结构为[Pd(en)(N1-5'-d GMP)],另一种产物经HPLC-DAD解析发现紫外吸收光谱与[Pd(en)(N1-5'-d GMP)]完全相同,HPLC-ICP-MS发现产物含Pd量也与[Pd(en)(N1-5'-d GMP)]相同,结合文献推断另一产物为[Pd(en)(N1-5'-d GMP)]的多聚物。研究表明,[Pd(en)(N1-5'-d GMP)]易在酸性条件下生成,其多聚物易在碱性条件下生成,在反应体系pH=6.0时,[Pd(en)(N1-5'-d GMP)]在12 h内生成且稳定存在。HPLC-ICP-MS图谱显示随着反应pH的增加两种产物的总量逐步减少。

免疫佐剂胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸1826对小鼠白血病的免疫治疗作用

背景与目的:肿瘤疫苗作为一种肿瘤特异性主动免疫治疗的手段,在其生物学治疗中起着重要作用。本研究探讨免疫佐剂胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸(cytidine-phosphatte-guanonine oligodeoxynucleotides,CpG ODN)1826在白血病动物模型中的抗瘤作用和毒副作用。方法:建立急性淋巴细胞白血病动物模型,在不同时间用灭活的L1210细胞和免疫佐剂皮下注射给DBA/2小鼠,观察小鼠一般状况、成瘤率、而且瘤块生长情况;通过病理切片了解瘤块中心及周围浸润细胞情况。结果:与对照组比,灭活细胞加GpG ODN1826瘤苗可以降低小鼠成瘤率,而且成瘤小鼠瘤块有消退现象,瘤周单个核细胞浸润明显,瘤块内肿瘤细胞坏死明显;但生存期无明显延长。结论:应用GpG ODN1826瘤苗可以加强白血病小鼠的抗瘤作用,但非荷瘤小鼠有死亡现象,需对GpG ODN1826瘤苗进行改进或筛选其他适合临床应用的免疫佐剂。

射频消融联合胞嘧啶鸟嘌呤寡脱氧核苷酸治疗小鼠乳腺癌皮下模型

目的观察射频消融联合瘤周注射胞嘧啶鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（CpGODN）对BALB／c小鼠皮下种植性乳腺癌的治疗作用及对荷瘤鼠免疫功能的影响。方法32只BALB／c小鼠双侧胁肋部皮下接种乳腺癌细胞EMT-6，建立乳腺癌动物模型，随机分为4组，每组8只，分别给予左侧皮下肿瘤射频消融＋瘤周注射CpGODN、射频消融、瘤周注射CpGODN和瘤周注射生理盐水4种处理。定期测量治疗侧及非治疗侧肿瘤大小，尾静脉取血法收集各组小鼠外周血，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清白细胞介素（IL）-12、IL-10、IL-2及干扰素（IFN）-γ含量。当非治疗侧肿瘤直径达到18mm时手术切除肿瘤，并记录为非治疗侧观察终点，当治疗侧肿瘤直径达到18min时或出现恶病质时处死小鼠，记录生存时间。结果射频消融＋瘤周注射CpGODN组和射频消融组治疗侧肿瘤体积体积显著小于CpGODN组和对照组（P〈0．05）。射频消融＋瘤周注射CpGODN组未治疗侧的肿瘤体积在第21天后明显小于其他各组（P〈0．05）。射频消融＋瘤周注射CpGODN组中位生存时间为92d，射频消融组为84d，瘤周注射CpGODN组为64d，对照组为60d。射频消融＋瘤周注射CpGODN组小鼠外周血中IL—12浓度为312．40ng／L，IL-10浓度为216．34ng／L，IL-2浓度为75．33ng／L，IFN-γ浓度为69．32ng／L，显著高于其他3组（P〈0．05）。结论射频消融联合瘤周注射CpGODN能激活小鼠体内的抗肿瘤免疫效应，起到抑制肿瘤生长作用。

HPLC测定脱氧核苷酸钠的含量和有关物质

目的 HPLC测定脱氧核苷酸钠的含量和有关物质方法的建立。方法色谱柱为Agilent Zorbax SAX(4.6mm×250mm,5μm),流动相为0.05 mol.L-1磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.80 g加水800mL,用磷酸调节pH值至3.3,加水稀释至1000mL),流速0.5 mL.min-1,检测波长258 nm。结果脱氧核苷酸钠中脱氧胞嘧啶核苷酸(d-CMP)、脱氧腺嘌呤核苷酸(d-AMP)、脱氧胸腺嘧啶核苷酸(d-TMP)、脱氧鸟嘌呤核苷酸(d-GMP)4种单核苷酸的进样量分别在0.017 6～3.382 7μg、0.019 6～3.758 0μg、0.014 8～2.847 7μg和0.018 0～3.452 8μg内与峰面积线性关系良好(r均为1.000);d-CMP、d-AMP、d-TMP、d-GMP的平均回收率分别为96.73%,97.51%,97.98%,98.39%;RSD分别为0.17%,0.39%,1.32%,0.32%(n=9);精密度、重复性良好。结论采用本方法主峰与杂质峰的分离度好,结果准确可靠,灵敏度高,为本品质量标准的修订和提高提供了基础。

正源负源比较液质联用测定酶解液中脱氧核苷酸含量

目的:建立一种快速灵敏的同时测定DNA酶解液中5′-腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、5′-胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dT-MP)、5′-鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)、5′-胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)的超高效液相色谱质谱(UPLC-MS)方法。方法:采用UPLC-MS色谱质谱系统,安捷伦ZORBAXSBAq-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);以20mmol.L-1醋酸铵缓冲盐溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱(0～10min,B相从5%→10%;10～11min,B相从10%→90%;11～15min,B相为90%;15～16min,B相从90%→5%;16～18min,B相为5%),流速0.6mL·min-1;在电喷雾正离子模式下,采用多反应监测模式(MRM)选择性监测5′-腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)(m/z332.1/81.1和332.1/136.2)、5′-胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)(m/z323.1/81.1和323.1/207.2)、5′-鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)(m/z348.1/152.1348.1/313.3)和5′-胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)(m/z308.1/81.1和308.1/112.1)。结果:5′-腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)、5′-胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)、5′-鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)和5′-胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)的线性范围分别为34.8～1160.0ng.mL-1(r=0.9997),32.8～820.0ng.mL-1(r=0.9997),60.0～1200.0ng.mL-1(r=0.9990),37.6～940.0ng.mL-1(r=0.9998),检出限分别为9.4,8.48,11.43,10.35ng·mL-1;定量限分别为31.35,28.28,38.10,34.50ng·mL-1;样品加标回收率为71.1%～117.2%;日内、日间精密度试验的RSD为0.94%～4.99%。结论:该方法快捷,灵敏度高,专一性强,重复性好,可用于DNA酶解液中4种脱氧核苷酸的分析。

两种CpG ODN佐剂对小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究

为了比较免疫佐剂CpG ODN1826和CpG ODN2006在白血病局灶肿瘤动物模型中的抗瘤作用和毒副作用,筛选合适的免疫佐剂,建立了急性淋巴细胞白血病局灶肿瘤动物模型,在不同时间用灭活的L1210细胞和不同免疫佐剂给DBA/2小鼠皮下注射,观察小鼠一般状况、成瘤率、瘤块生长情况,了解瘤块病理情况。结果表明:灭活细胞加CpGODN1826瘤苗可以降低小鼠成瘤率,成瘤小鼠的瘤块生长缓慢,瘤块内部肿瘤细胞坏死明显,但生存期无明显延长;CpGODN2006组小鼠成瘤率不但降低,瘤块缩小,而且生存期也明显延长,已生长的肿瘤消退。结论:应用CpGODN2006瘤苗可以增强白血病局灶肿瘤小鼠的抗瘤作用,使生存期明显地延长,无明显的毒副作用。

CpG对X线放射治疗Lewis肺癌小鼠移植瘤的增敏效应

目的:探讨含胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤基序的寡脱氧核苷酸(cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotide,CpG ODN)对X线照射荷瘤小鼠Lewis肺癌的放疗增敏作用。方法:在小鼠右前腋窝接种Lewis肺癌细胞,制备荷瘤小鼠模型,将32只荷瘤小鼠随机分为4组:对照组,无任何处理;X线照射组,3 Gy/次,第1、3、5、8、10、12天照射,总剂量18Gy;CpG组,第1、3、5、8、10、12天注射,每次腹腔注射CpG ODN 0.05 mg;D组:CpG+X线照射组,每次X线照射前6 h腹腔注射CpG ODN观察各组移植瘤生长速度和各治疗组移植瘤生长延迟时间,H-E染色法观察移植瘤组织病理变化,TUNEL法检测细胞凋亡结果:成功建立荷Lewis肺癌小鼠模型,经治疗后各组小鼠移植瘤体积都较对照组明显减小(P<0.01),CpG+X线照射组移植瘤体积最小;X线照射组移植瘤的生长延迟时间为2.1 d,CpG组为2.3 d,CpG+X线照射组为4.8 d,CpG ODN的放射增敏比为2.09。H-E染色病理观察到各治疗组都较对照组移植瘤坏死明显,CpG+X线照射组最显著TUNEL法检测对照组瘤组织细胞凋亡率为(2.75±0.89)%,X线照射组为(4.87±1.13)%,CpG组为(7.63±1.41)%,CpG+X线照射组为(32.63±4.66)%;各治疗组都明显高于对照组,CpG+X线照射组显著高于X线放射组和CpG组(P<0.01)。结论:CpG OND能明显提高Lewis肺癌移植瘤对X线的放射敏感性,促进肿瘤细胞凋亡。

IL-12基因修饰瘤苗联合CpG-ODN治疗小鼠眼内黑色素瘤的研究

目的:观察白细胞介素-12(Interleukin-12,IL-12)基因修饰瘤苗联合含非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)基序的寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucletide,ODN)即CpG-ODN治疗小鼠眼内黑色素瘤的疗效。方法:将荷瘤模型鼠分为磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)治疗组,IL-12基因修饰肿瘤细胞疫苗(gene modified tumor cell vaccine,GTV)治疗组及GTV联合CpG-ODN(GTVC)治疗组;鼠荷瘤模型建立后的第3d及第10d分别在各组鼠结膜下注射30μLPBS,30μL(3.0×106个细胞)灭活的GTV及含20μgCpG-ODN灭活的GTV,进行角膜溃破时间、淋巴结和肺部转移瘤发生率、生存时间及外周血CD4+和CD8+T细胞比例的观测。结果:GTV组及GTVC组角膜溃破晚于PBS组时间,前两组间差异无统计学意义;鼠荷瘤模型建立后的第18d,GTV组及GTVC组颈部淋巴结转移瘤发生率低于PBS组,前两组组间差异无统计学意义;鼠荷瘤模型建立后的第28d,GTVC组鼠肺转移瘤发生率低于PBS组及GTV组,后两组组间差异无统计学意义;PBS组及GTV组的外周血中CD4+与CD8+T细胞比值下降,GTVC组与阴性对照组组间差异无统计学意义;GTVC组小鼠生存时间长于另两组。结论:新型免疫佐剂CpG-ODN可增强IL-12基因修饰瘤苗的抗眼内黑色素瘤效应。

CpG ODN对卡铂治疗Lewis肺癌小鼠移植瘤的增敏效应

目的：探讨含胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤基序的寡脱氧核苷酸（cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotide,CpGODN）对卡铂治疗Lewis肺癌荷瘤小鼠的化疗增敏作用。方法：在小鼠右前肢腋窝接种Lewis肺癌细胞,制备荷瘤小鼠模型,将32只荷瘤小鼠随机分为4组：对照组,不做任何处理;卡铂治疗组,第1~5天每天腹腔注射卡铂注射液0.32mg;CpG组,第1~5天每次腹腔注射CpGODN（1826）0.05mg;CpG＋卡铂组,每次卡铂注射前6h腹腔注射CpGODN（1826）。观察各组移植瘤生长速度和重量,HE染色法观察移植瘤组织病理变化,TUNEL法检测细胞凋亡。结果：成功建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型。各治疗组小鼠肿瘤体积都较对照组明显减小（P〈0.01）,其中CpG＋卡铂组移植瘤体积最小;卡铂组、CpG组、CpG＋卡铂组的抑瘤率分别为23.35%、21.47%、48.43%;HE染色法观察到各治疗组移植瘤的坏死均较对照组明显,其中CpG＋卡铂组最明显。TUNEL法检测对照组瘤组织细胞凋亡率为2.75%±0.89%,卡铂组为4.87%±1.13%,CpG组为7.63%±1.41%,CpG＋卡铂组为32.63%±4.66%,各治疗组瘤细胞凋亡率均明显高于对照组（P均〈0.01）,其中CpG＋卡铂组显著高于单独卡铂组和单独CpG组（P均〈0.01）。结论：CpGODN（1826）能明显提高Lewis肺癌移植瘤对卡铂治疗的化疗敏感性,促进肿瘤细胞凋亡。

动物免疫增强剂的研究进展

免疫增强剂可促进动物对抗原的免疫应答反应,显著增强疫苗的免疫效果。文章综述了动物疫苗研究领域中的免疫增强剂,如免疫刺激复合物、脂质体、细胞因子、胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸和天然产物对动物疫苗免疫效果的影响,并对免疫增强剂的发展趋势作了展望。

siRNA沉默ATM增强CpG ODN 7909对肺癌A549细胞的放射增敏作用

目的:研究siRNA沉默毛细血管扩张—共济失调突变(atxia-telangiectasia mutated,ATM)基因的表达增强胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸(cytosine-phophate-guanine oligodeoxynucleotide,CpG ODN)7909对人非小细胞肺癌A549细胞的放射增敏作用。方法:将ATM-siRNA转染至A549细胞中,Western blotting检测A549细胞中ATM蛋白的表达。A549细胞随机分为6组:对照组、CpG组、X射线(IR)组、CpG+IR组、ATM-siRNA+CpG+IR组和NC-siRNA+CpG+IR组,克隆形成分析法检测各组细胞克隆形成率,Graphpad prism 5.0软件进行单击多靶模型和L-Q线性模型拟合辐射后A549细胞的生存曲线,以D0、Dq、N、α/β及SF2等参数分析A549细胞辐射损伤修复能力,流式细胞术检测A549细胞的凋亡。结果:ATM-siRNA转染可明显抑制A549细胞中ATM蛋白的表达(P<0.01)。X射线可剂量依赖性抑制A549细胞的克隆形成能力(P<0.05);且CpG+IR组A549细胞的克隆形成能力进一步降低(P<0.01);ATM-siRNA转染后,CpG处理的A549细胞克隆形成能力再度降低[10 Gy时,(0.05±0.00)%vs(0.71±0.00)%,P<0.01]。辐射损伤剂量生存曲线结果显示,ATM-siRNA转染后,ATM-siRNA+CpG+IR组较CpG+IR组A549细胞的α/β值明显增大(1.48 vs 0.97,P<0.05),对放射损伤修复能力明显减弱。CpG+IR组较IR组细胞凋亡率显著升高[(9.18±0.16)%vs(6.56±0.33)%,P<0.01];ATM-siRNA+CpG+IR组A549细胞凋亡率进一步升高[(10.45±0.40)%vs(9.18±0.16)%,P<0.05]。结论:siRNA沉默ATM的表达可增强CpGODN 7909对A549细胞的放射增敏作用,ATM可作为肺癌治疗的潜在靶点。

CpG-ODN DSP30联合IL-2刺激在慢性B淋巴细胞增殖性疾病细胞遗传学检测中的临床价值

目的 探讨未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)DSP30联合白细胞介素-2(IL-2)刺激在慢性B淋巴细胞增殖性疾病(B-CLPD)细胞遗传学检测中的应用价值。方法 选取2020年1月至2021年6月天津金域医学检验实验室的491例B-CLPD患者骨髓标本作为研究对象,将其中240例慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者作为CLL组,251例非CLL的其他B-CLPD患者作为non-CLL组。将每例骨髓标本分为2份,一份为实验组,一份为对照组,同步进行培养。实验组采用CpG-ODN DSP30联合IL-2刺激细胞并培养72 h,对照组采用常规培养细胞48 h,培养完成后收集细胞并制备染色体,应用G显带技术进行核型分析,比较实验组和对照组染色体核型培养成功率和染色体核型异常检出率的差异,并比较CLL组与non-CLL组的染色体核型异常情况。结果 实验组染色体核型培养成功率和异常检出率均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。与CLL组比较,non-CLL组高水平复杂核型及复杂核型占比更高,更易出现14q32(IGH)重排、6q-、7q-、+3及+18。结论 采用CpG-ODN DSP30联合IL-2刺激能明显提高B-CLPD的细胞遗传学异常检出率,并且在非CLL的B-CLPD中同样具有重要价值。

多氯联苯增强苯并(a)芘致HepG2细胞DNA的损伤作用

目的研究多氯联苯1254对苯并(a)芘致HepG2细胞DNA损伤的影响。方法设11.5、23.0和46.0μmol/L多氯联苯1254剂量组,苯并(a)芘50μmol/L剂量组,10 m l/L二甲基亚砜为溶剂对照。用不同浓度多氯联苯1254预处理HepG2细胞,24 h后染毒,通过单细胞凝胶电泳和高效液相-电化学技术,检测细胞中的DNA链断裂和8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷酸(8-OHdG)。结果50μmol/L苯并(a)芘诱导HepG2细胞中DNA O liver尾矩(OTM)值为1.66±0.21,8-OHdG含量为(23.31±6.02)8-OHdG/106dG,溶剂对照组OTM值为0.79±0.15,8-OHdG含量为(12.31±3.24)8-OHdG/106dG,两组比较差异均有统计学意义;11.5、23.0和46.0μmol/L单独处理组OTM值分别为0.88±0.20、1.01±0.15和1.10±0.16,8-OHdG含量分别为(19.57±7.57)、(22.80±9.16)和(31.74±9.25)8-OHdG/106dG,46.0μmol/L组与溶剂对照组比较,8-OHdG含量显著增加,差异有统计学意义;经11.5、23.0和46.0μmol/L的多氯联苯1254预处理,苯并(a)芘诱导的OTM值分别为2.14±0.22、2.43±0.32和2.71±0.31,8-OHdG含量分别为(32.50±3.81)、(49.23±16.66)和(60.36±18.04)8-OHdG/106dG,与苯并(a)芘单独作用组比较均显著增加,差异有统计学意义。结论多氯联苯1254能使苯并(a)芘诱导的HepG2细胞DNA损伤作用显著增强,表明多氯联苯1254对苯并(a)芘的遗传毒性作用具有一定的协同效应。

MTH2蛋白在快速老化P8小鼠海马中表达的增龄性变化

目的观察8氧鸟嘌呤脱氧核苷三磷酸酶同源蛋白2（MTH2）在快速老化P8小鼠（SAMP8）海马中的表达，探讨其与SAMP8增龄性变化的关系。方法该实验选用1、4、8、12月龄的sAMP8及同龄的抗快速老化R1小鼠（SAMR1）作为实验对象，每组8只，用免疫组化和免疫印迹法分别检测海马中MTH2蛋白的表达。结果免疫组化结果显示，MTH2主要在SAMP8神经元胞浆内表达；海马不同区域均有表达，尤以CA1和CA3区表达最多。定量结果显示，SAMR1海马各区域MTH2的表达随增龄无显著性改变；而在SAMP8MTH2的表达随月龄增加而下降，8月龄海马CA1区的吸光度值（A值）为0．0473、CA3区为0．0510，显著低于4月龄海马CA1区的0．0619、CA3区的0．0680；12月龄海马CA1区的A值为0．0369、CA3区为0．0465，显著低于8月龄；8月和12月龄A值SAMP8分别显著低于同龄的SAMR1（P〈0．05）。免疫印迹结果显示，4～12月龄SAMP8海马内MTH2表达的灰度值（greylevel）分别为0．529、0．313、0．032，显著低于同龄SAMR1（P〈0．05）。结论MTH2蛋白的表达量在SAMP8随增龄而下降，8月龄和12月龄SAMP8的MTH2蛋白表达量与同龄对照组比较差异有统计学意义，提示MTH2蛋白表达量的减少与SAMP8的快速老化相关。

青石棉诱导A_L细胞CD59基因突变和DNA氧化损伤的研究

目的 研究谷胱甘肽合成酶抑制剂buthioninesulfoximine(BSO)和自由基清除剂二甲亚砜 (DMSO)对青石棉诱导人鼠杂交瘤 (AL)细胞CD59基因突变率的影响以及青石棉引发细胞内 8 羟基脱氧鸟苷 (8 OHdG)产生的规律。方法 细胞毒性、遗传毒性检测分别采用克隆法 ;8 OHdG检测采用ABC酶免疫染色法 ;非蛋白巯基化合物 (NPSH)检测采用改进后的Tietze法。结果 2 5μmol/LBSO预处理AL 细胞 2 4h后的细胞内NPSH含量降为 2nmol/ 10 7细胞 ,仅为对照组的 5%。青石棉单独处理组AL 细胞CD59基因突变率为 2 0 8± 18。BSO预处理 2 4h后与青石棉继续共同孵育组细胞突变率可达到 3 97± 55,是青石棉单独处理组的 2倍左右 ,差异有显著性 (P <0 .0 5) ;而DMSO存在时 ,青石棉诱导的CD59基因突变率仅为 57± 8,比青石棉单独处理组降低 72 .6%。细胞内 8 OHdG的产生随着青石棉处理剂量的增加而线性增加 (y =150 + 2 0x ,r =0 .962 1)。当青石棉处理剂量为 6μg/cm2 时 ,细胞内 8 OHdG含量由对照组的 13 7± 9提高到 2 89± 6,是对照组的 2倍以上。DMSO存在时 ,可使 6μg/cm2 石棉诱导的细胞内 8 OHdG含量由 2 89± 6降低到 170± 3。结论 自由基是青石棉诱导基因突变和DNA损伤过程中重要的调节物 ,具有剂量

可见光对视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响

目的观察可见光对体外培养视网膜色素上皮（RPE）细胞内活性氧（ROS）、8-羟基一2L脱氧鸟瞟呤（8-OHdG）和8一羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶l（h（）GGl）表达的影响。方法人RPE-19细胞按1：4至1：6传代培养。取第4～6代80％融合细胞用于实验。细胞分为白光、红光、蓝光照射组和对照组，细胞平面光照强度为600Lux。白光，红光分别照射6、12、24、48h；蓝光照射1、3、6、12h；对照组以锡纸包裹避光培养。2’，7＇-二氯荧光素二乙酸酯（DCFHDA）法检测细胞内ROS表达量，免疫细胞化学（ICG）法检测细胞内8—0HdG表达量，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞内h0GGl表达情况。结果DCFH—DA法检测结果显示，白光、红光照射组分别照射12、24、48h，蓝光照射组照射1、3、6、12h，细胞内ROS表达量均升高且随时间延长而增加，与对照组细胞内ROS表达量比较，差异均有统计学意义（F白光=11．6jl，F红光=6．706，F蓝光=23．259；P〈O．05）。ICG法检测结果显示，白光、红光照射组分别照射12、24、48h，细胞胞浆8～OHdG表达量增高，照射后12、24h表达量随时间延长而增加，48h有所降低，与对照组细胞胞浆8-OHdG表达量比较，差异均有统计学意义（F白光=16．032，F红光=6．378；P〈0．05）；蓝光照射组照射后1、3、6、12h，细胞胞浆8-OHdG表达量均增高，照射后6、12h细胞胞浆8-OHdG表达量较1、3h细胞胞浆8—OHdG表达量有所降低，但与对照组细胞胞浆8-OHdG表达量比较，差异均有统计学意义（F蓝光=19．484，Pd0．01）。Western blot检测结果显示，白光、红光照射组照射12、24、48h，蓝光照射组照射6、12h，细胞内hOGGl表达量均增高，与对照组细胞内hOGGl表达量比较，差异均有统计学意义（F白光=15．121，F红光=21．041；F蓝光=12．479，P〈o．05）。结论白光、红光、蓝光能以时间依赖性方式诱导RPE细胞ROS生成增加并导致RPE细胞DNA氧化损伤。RPE细胞在可见光作用下能增加DNA糖基化酶hOGG1的表达量以对DNA氧化损伤进行修复。

TLR9通路激活对原代肾小管上皮细胞转录组的影响

目的探讨Toll样受体9(TLR9)信号通路激活对肾小管细胞转录组的影响。方法提取并培养小鼠原代肾小管上皮细胞,在细胞融合度达80%时分为两组,分别加入10μL磷酸盐缓冲液(PBS,PBS对照组)和终浓度为5μmol/L的TLR9激活剂胞嘧啶-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(CpG-ODN,CpG-ODN处理组)。提取细胞RNA后在Illumina平台进行测序,使用差异基因分析软件DEGseq分析两组细胞中基因的差异表达情况,通过Goatools和KOBAS在线软件分析差异基因所参与的信号通路,应用Homer软件预测转录因子。结果与PBS对照组相比,CpG-ODN处理后有584个显著的差异表达基因,其中102个基因表达上调,482个表达下调。差异表达基因富集最显著的基因本体(GO)为β-干扰素响应、病毒响应或防御等炎症反应相关条目;京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)信号通路富集结果显示,富集系数最显著的信号通路包括2’-5’-寡腺苷酸合成酶活性、核糖核酸酶活性的调节、病毒生命周期的负调控、β-干扰素响应和对原生动物的防御反应等。转录因子预测结果显示,干扰素调节因子3(IRF3)是差异基因启动子序列上富集最显著的转录因子;IRF3是TLR9下游表达差异最显著的转录因子,转录因子21(TCF21)、锌指蛋白135(ZNF135)和阳性调节域4(PRDM4)等转录因子可能是TLR9信号通路的新候选靶标。结论CpG-ODN激活TLR9信号通路,原代肾小管上皮细胞能直接响应CpG-ODN的刺激并发生转录组学变化,为进一步探究TLR9信号通路在脓毒症相关性急性肾损伤中的分子机制研究提供了基础。