甾醇脱氢酶的基因挖掘、分子改造及其催化合成熊去氧胆酸

本文介绍近年来利用以甾醇脱氢酶为核心元件的生物合成法制备熊去氧胆酸的研究进展,并提出了该技术进一步发展所面临的挑战和未来的研究方向,旨在为熊去氧胆酸的生物合成研究提供参考。

葡萄胶孢炭疽菌对3种麦角甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂的敏感性

系统比较了从云南省主要葡萄产区采集的57株葡萄胶胞炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides对三唑类脱甲基抑制剂烯唑醇、腈菌唑及咪唑类脱甲基抑制剂咪鲜胺的敏感性、交互敏感性及敏感性与生存适合度的相关性等指标。结果表明:供试菌株对咪鲜胺的EC50值在0.01～1.58 mg/L之间,高于其对烯唑醇(EC50值为0.05～25.45 mg/L)和腈菌唑(EC50值为0.49～192.93 mg/L)的敏感性;部分菌株对烯唑醇和腈菌唑的敏感性显著降低,而对咪鲜胺仍保持较高的敏感性;供试菌株对烯唑醇和腈菌唑的敏感性具有显著的相关性,而对咪鲜胺的敏感性与对烯唑醇和腈菌唑的敏感性之间则无显著相关性。低敏感性菌株的致病力和菌落生长速率与敏感菌株无显著差异,具有较高的生存适合度。

甘肃省枸杞炭疽病菌对4种甾醇脱甲基抑制剂的敏感性

为明确甘肃省枸杞炭疽病菌对甾醇脱甲基抑制剂类药剂(DMIs)的敏感性,采用菌丝生长速率法测定了采自甘肃省靖远县3个地区及景泰县3个地区共102株枸杞炭疽病菌对苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑及氟硅唑的敏感性,分别就不同年份、不同地区间胶孢炭疽复合种和尖孢炭疽复合种对4种DMIs杀菌剂的敏感性差异进行了分析。结果表明:供试46株枸杞胶孢炭疽复合种整体上对苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑和氟硅唑仍表现为敏感,EC50值分别在0.28~1.20、0.11~2.98、0.32~2.84和0.35~3.85μg/mL之间;而56株尖孢炭疽复合种对4种药剂的敏感性则出现了不同程度分化,部分菌株疑似已出现敏感性下降现象,其中,对苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑和氟硅唑敏感性最低的菌株EC50值分别为1.63、3.80、6.21和4.74μg/mL。不同年份间采集的枸杞胶孢炭疽复合种和尖孢炭疽复合种对4种杀菌剂的敏感性均存在显著差异,2017年采集的菌株敏感性相对更低,4种杀菌剂对胶孢炭疽复合种的平均EC50值分别为(0.84±0.03)、(1.23±0.13)、(1.19±0.09)和(1.69±0.17)μg/mL,对尖孢炭疽复合种的平均EC50值分别为(1.06±0.03)、(2.25±0.15)、(2.43±0.20)和(2.85±0.19)μg/mL。不同地区枸杞炭疽病菌对4种杀菌剂的敏感性表现不同,其中靖远县五合镇的胶孢炭疽复合种对4种杀菌剂敏感性最低,平均EC50值分别为(0.79±0.12)、(1.28±0.87)、(1.39±1.05)和(1.74±1.04)μg/mL,景泰县草窝滩镇的胶孢炭疽复合种对苯醚甲环唑和丙环唑敏感性最高,平均EC50值为(0.28±0.10)和(0.46±0.10)μg/mL,对戊唑醇和氟硅唑敏感性最高的胶孢炭疽复合种来自景泰县寺滩乡,平均EC50值为(0.42±0.16)和(0.65±0.09)μg/mL;不同地区间采集的尖孢炭疽复合种对4种杀菌剂的敏感性则不存在显著差异。研究结果可为甘肃省枸杞炭疽病防治中杀菌剂的合理使用及延缓抗药性发展提供依据。

灰霉病菌对甾醇脱甲基抑制剂(DMIs)的敏感性

研究了灰霉病菌(Botryotis cinerea)对甾醇脱甲基抑制剂(DMIs)的敏感性,结果表明供试的3种DMIs类化合物抑制灰霉病菌菌丝生长的活性依次为戊唑醇>戊菌唑>三唑酮。戊唑醇对采自浙江、江苏、山东三地的114株灰霉病菌菌丝生长的有效抑制中浓度(EC50)值在0.001～0.917μg/mL之间,平均为0.225μg/mL;戊菌唑的EC50值在0.007～3.590μg/mL之间,平均为0.644μg/mL;三唑酮的EC50值在0.040～83.646μg/mL之间,平均为9.032μg/mL。同时,未发现供试的3种DMIs类化合物与目前在生产上应用的苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、N-苯胺基甲酸酯类和苯胺基嘧啶类等主要灰霉病防治药剂之间存在交互抗药性。

禾谷镰刀菌甾醇14α脱甲基酶基因cDNA克隆及生物信息学分析

克隆获得禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)2个甾醇14α脱甲基酶CYP51蛋白(CYP51A、CYP51B)基因c DNA序列,明确其氨基酸序列典型特征,为研究蛋白质结构及其抗药性机制奠定基础。采用RT-PCR技术,克隆2个CYP51蛋白基因c DNA序列,利用相关生物信息软件对其序列进行生物信息学分析。结果克隆到2条c DNA序列,长度分别为1 524、1 581 bp,分别编码507、526个氨基酸;2个蛋白分子量分别为57.5、59.3 ku,等电点分别为6.93、7.08,不稳定系数分别为49.43、39.05;2个蛋白均含有细胞色素P450家族成员典型的保守结构域;不具有信号肽的属于非分泌性蛋白,具有跨膜结构域,是亲水性蛋白;蛋白质二级结构最主要的结构元件是α螺旋、无规则卷曲,并散布于整个蛋白中;亚细胞定位预测显示,CYP51A蛋白主要位于内质网及高尔基体等细胞器中,而CYP51B主要位于细胞质中。研究结果将为进一步研究CYP51蛋白生物学功能及其蛋白结构生物学提供参考。

羊毛甾醇脱甲基酶变化导致假丝酵母耐药的分子生物学研究进展

假丝酵母是临床常见的条件致病菌 ,抗生素的滥用及放化疗和免疫抑制剂广泛使用 ,使得假丝酵母的感染机会增加 ,针对常见的吡咯类抗真菌药的耐药现象逐年增加。其耐药途径较多 ,包括细胞膜对药物的通透性下降 ,药物在细胞内降解 ,甾醇合成路径的改变 ,细胞膜的排出泵作用增强 ,甾醇合成酶的性质变化等。与假丝酵母耐药性相关的细胞色素 P- 45 0羊毛甾醇脱甲基酶的基因存在 4种改变 :(1)点突变 ;(2 )基因过度表达 ;(3)基因扩增 ;(4 )基因转换或有丝分裂重组 ,导致靶酶的生物学特性变化 ,及其与假丝酵母耐药性的相互关系。表明假丝酵母编码靶酶的基因的变化可导致靶酶一级结构改变和空间构象变化 ,影响药物对靶酶的亲和性 ,或导致靶酶量的变化 ,影响药物的作用 ,产生耐药性。

植物病原真菌对甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂抗性分子机制研究进展

甾醇脱甲基抑制剂(DMI)可通过抑制病原真菌的14α-去甲基化酶(CYP51)而干扰或阻断细胞膜麦角甾醇的生物合成,造成有毒甾醇积累,从而影响细胞膜的结构及功能,进而发挥抗菌作用。随着DMI类杀菌剂的广泛应用,病原菌对其的抗性问题日益严重。本文从抗药性分子机制出发,总结出病原菌对DMI类杀菌剂产生抗性的主要原因为:CYP51氨基酸突变引起其与杀菌剂间的亲和力下降;启动子区域基因片段的插入引起CYP51基因过表达;转录因子激活突变或启动子区域基因片段插入导致外排蛋白基因过表达。本文基于杀菌剂的作用方式及病原菌抗性机制研究展开综述,可为杀菌化合物的结构修饰与优化、新靶点改进和研发以及病原真菌的抗药性治理提供参考。

槭菌刺孢对5种甾醇脱甲基抑制剂的敏感性

由槭菌刺孢Mycocentrospora acerina(R.Hartig)Deighton引起的圆斑病是危害三七Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen的重要叶部病害,严重影响中药材三七的产量和质量。为探索槭菌刺孢对甾醇脱甲基抑制剂类(DMIs)杀菌剂的敏感性,采用菌丝生长速率法测定了45株槭菌刺孢对氟硅唑、苯醚甲环唑、烯唑醇、丙环唑和戊唑醇5种杀菌剂的敏感性,并分析了病原菌对这5种杀菌剂敏感性的相关性。结果表明:氟硅唑、苯醚甲环唑、烯唑醇、丙环唑和戊唑醇对供试菌株的EC_(50)值分别在0.04~3.81、0.18~6.72、0.08~7.75、0.44~11.38和0.46~29.85μg/mL之间;敏感性频率分布测定结果表明,5种杀菌剂对呈连续单峰频次正态分布的大多数菌株群体的平均EC_(50)值分别为(0.99±0.64)、(1.77±0.97)、(2.37±1.39)、(2.61±1.48)和(3.18±1.58)μg/mL,供试菌株群体中已出现对5种杀菌剂敏感性降低的亚群体,且供试菌株对这5种DMIs杀菌剂均存在较强的交互抗性,而菌株对氟硅唑和苯醚甲环唑的交互抗性相关系数最高,为0.989。本研究结果可为云南省三七圆斑病防治中甾醇脱甲基抑制剂的合理使用提供理论依据。

甾醇14α-脱甲基酶CYP51蛋白结构及其抗药性功能研究进展

禾谷镰孢菌(Fusarium gra minearum)是引起小麦赤霉病的主要病原真菌,其细胞色素P450甾醇14α-脱甲基酶(CYP51)是唑类杀菌剂作用的主要靶标蛋白。本文在简要介绍小麦赤霉病在中国发生危害与防控现状的基础上,重点探讨了甾醇14α-脱甲基酶的结构及功能、病原真菌对唑类杀菌剂的抗药性研究现状和抗药性治理研究进展,以期对小麦赤霉病的高效防治、减少或延缓抗药性的发生以及对抗药性的治理提供新的思路。

3β-羟甾醇脱氢酶/异构酶的特征、活性调节和抑制剂的研究

3β-羟甾醇脱氢酶/异构酶分子量41kD±,为均一的蛋白多肽链,催化孕烯醇酮的脱氢和异构反应,为甾体激素合成过程中的关键酶,以NAD^+或NADH为辅助因子。其活性受产物及体内蛋白或多肽因子调节。epostane类化合物、3-氧,4-氮杂甾醇类化合物对此酶有抑制作用。3β-羟甾醇脱氢酶/异构酶的特征、活性调节和抑制剂的研究对生殖生理和计划生育都具有十分重要的意义。

甾醇C-4脱甲基多酶体系中Erg28p蛋白的关键作用位点分析

酿酒酵母细胞膜中含有丰富的甾醇类活性物质,是活性维生素D及激素类药物的重要中间体。生物甾醇合成反应中,甾醇C-4位脱甲基反应过程复杂,是甾醇活化的关键步骤,涉及了三步连续的氧化还原反应。通过生物信息学分析预测Erg28p蛋白的关键作用位点,构建了一组Erg28p蛋白的截短突变表达载体,分别检测其麦角甾醇合成代谢途径中的中间代谢物,发现并证实了Erg28p蛋白的关键作用残基63-72位氨基酸对酿酒酵母甾醇合成代谢的影响。

天然维生素E的提取

对经酯化、脱甾醇处理后的油脂脱臭物采用简单蒸馏方法提取维生素E。结果表明维生素E的收率在87%以上,产品含量达51%以上。

7-脱氢胆甾醇合成功能模块与底盘细胞的适配性

利用合成生物技术生产7-脱氢胆甾醇的挑战性在于获得合成功能模块与底盘细胞的适配关系。从更换不同调控强度的启动子和不同改造的酵母底盘两方面,对二者的适配性进行研究,以增加7-脱氢胆甾醇产量:过表达酵母固醇合成途径中的内源基因tHMGR和ERG1,敲除非必需基因ERG6和ERG5以抑制酵母固醇向麦角固醇的转化,得到改造后的酵母底盘SyBE_000956;利用由强到弱依次为TDH3p、PGK1p和TDH1p的启动子,引入人源C-24还原酶基因DHCR24,构建3种强度的外源功能模块,并分别导入3种底盘中,得到9种人工合成细胞。结果表明,TDH3p调控的功能模块与底盘细胞SyBE_000956具备较好的适配性,实现7-脱氢胆甾醇产量的提高。为后续的适配性研究提供了理性设计的依据。

双波段紫外光合成维生素D_3实验研究

报道了双波段紫外光照射 7 脱氢胆甾醇合成维生素D3的放大实验研究 ,发现它与激光两步照射合成法产物随时间变化曲线非常相似 ,维生素D3的前身P3的转化率约为 61 % 。

高效液相色谱联合红外光谱剖析医药-护肤液成分

采用溶剂抽提和几种仪器联合分析的方法剖析了医药 护肤 化妆液的成分。通过高效液相色谱 (HPLC)、红外光谱 (IR)、元素分析等仪器对药 液抽提浓缩段的联合分析 ,准确地确定药液中主要有效成分为甲基脱氢皮质甾醇醋酸酯 ,还以HPLC定性、定量检测了药液中其它成分。

生物合成7-脱氢胆甾醇酵母底盘的初探

7-脱氢胆甾醇是生产维生素D3的关键前体,目前利用化学合成和生物转化生产7-脱氢胆甾醇的方法无法适应大规模工业生产的需要,合成生物学的出现为次级代谢物的异源合成提供了新的选择,酿酒酵母和解脂酵母都是适用于工业生产的底盘生物。在酿酒酵母中,麦角固醇合成途径会抑制7-脱氢胆甾醇的合成,通过敲除麦角固醇合成途径上的非必需基因erg5并引入人源的C24还原酶基因dhcr24,可以实现在酿酒酵母中生产7-脱氢胆甾醇,摇瓶发酵产量为2.62 mg·L^(-1)。解脂酵母中7-脱氢胆甾醇的合成不受麦角固醇的影响,通过将人源的dhcr24基因整合到基因组r DNA位点上,7-脱氢胆甾醇的产量最高达到27.91 mg·L^(-1)。为寻找适合于异源表达甾醇类次级代谢物的酵母底盘提供了可供借鉴的研究方法,具有一定的指导意义。

暴马桑黄SbLSD基因克隆及差异表达分析

【目的】暴马桑黄是一种重要的药用资源,三萜是其发挥药用功效的主要成分,但是目前获取大量三萜仍然非常困难。通过对暴马桑黄三萜合成途径中的羊毛甾醇14α-脱甲基酶(lanosterol 14-alpha-demethylase,LSD)基因进行克隆及差异表达分析,以期深入了解暴马桑黄三萜合成的调控机理,进而提高三萜产量。【方法】采用PCR扩增得到LSD基因cDNA序列全长,利用生物信息学软件对该基因编码的氨基酸序列进行分析;采取同源重组方法构建原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,SDS-PAGE检测;qRT-PCR技术分析LSD基因在暴马桑黄不同发育阶段转录水平差异。【结果】暴马桑黄LSD基因cDNA全长1662 bp,编码553个氨基酸,相对分子量为62.26 kDa,命名为SbLSD(登录号为MN864180);跨膜区和亚细胞定位预测显示SbLSD蛋白是在内质网和高尔基体发挥作用的跨膜蛋白;系统进化树结果表明暴马桑黄和灵芝的LSD蛋白同源性最高,符合物种经典分类;SDS-PAGE结果证实在62.26 kDa附近出现目的蛋白条带,说明所获得的基因可以成功表达出蛋白;从荧光定量分析结果中可以看出SbLSD基因转录水平在不同发育阶段有差异性,并且在子实体阶段该基因转录水平最高,与羊毛甾醇合成的基因变化规律相吻合。【结论】通过对SbLSD基因的分子鉴定解析,为进一步揭示该基因在暴马桑黄三萜合成途径中的功能奠定基础。

暴马桑黄羊毛甾醇14α-脱甲基酶基因的克隆、序列分析及原核表达

为深入了解暴马桑黄三萜合成途径的调控机理,基于前期测得的转录组数据,同时结合基因组数据(GenBank登录号为LNZH00000000.2),筛选得到暴马桑黄羊毛甾醇14α-脱甲基酶(lanosterol 14-alpha-demethylase,LSD)基因序列,并设计特异引物。以暴马桑黄菌丝体总RNA反转录得到的cDNA为模板,采用PCR技术克隆得到LSD基因cDNA序列全长,命名为SbLSD1(登录号为MN640689)。序列分析结果表明,SbLSD1基因cDNA序列全长1 746 bp,编码581个氨基酸,分子量为65.96 ku,没有信号肽,在53~75位氨基酸序列之间含有一个跨膜螺旋结构,属于P450超家族成员。系统发育分析表明,暴马桑黄LSD1蛋白和灵芝LSD蛋白同源性最高。将SbLSD1基因cDNA序列构建到原核表达载体pET-32a上,获得重组质粒pET-32a-SbLSD1,然后将其转入Escherichia coliBL21中进行SbLSD1蛋白诱导表达。SDS-PAGE结果显示,SbLSD1基因成功表达出蛋白,并在63~75 ku出现与预期大小一致的蛋白条带。通过对SbLSD1基因的克隆及表达分析,为进一步研究该基因在暴马桑黄三萜生物合成过程中的功能奠定基础。

烟曲霉Cyp51A和Cyp51B生物学功能差异性分析

目的研究烟曲霉Cyp51A和Cyp51B的功能差异。方法利用系统发生分析研究烟曲霉Cyp51A和Cyp51B的进化关系,分别构建烟曲霉Cyp51A和Cyp51B编码基因的敲除菌株Δcyp51A和Δcyp51B,研究Δcyp51A和Δcyp51B在高温耐受性、伏立康唑敏感性和对大蜡螟幼虫致病力方面的差异性。结果系统发生分析显示,烟曲霉Cyp51A和Cyp51B进化距离较远。Δcyp51B对50℃的耐受性低于Δcyp51A和野生株。Δcyp51A对伏立康唑耐受水平下降程度明显高于Δcyp51B。Δcyp51B和Δcyp51A对大蜡螟幼虫致病力与野生株相比无显著性差异。结论Cyp51A和Cyp51B在烟曲霉高温耐受性和唑类药物耐受性中有功能差异。