脱细胞软骨细胞外基质匀浆联合氧化苦参碱治疗大鼠骨关节炎

背景:脱细胞软骨细胞外基质治疗骨关节炎具有一定的效果,但其单独应用时的治疗效果有限。氧化苦参碱可缓解白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解。目的:观察不同剂量氧化苦参碱与脱细胞软骨细胞外基质联合膝关节腔注射对大鼠骨关节炎的治疗作用。方法:获取SD大鼠股骨软骨,采用物理、化学与酶相结合的方法制备脱细胞软骨细胞外基质。取50只SD大鼠,利用随机数字表法分为假手术组、骨关节炎组、单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组,每组10只,后4组采用改良Hulth法建立大鼠骨关节炎模型。造模成功后,单纯材料组大鼠膝关节腔注射脱细胞软骨细胞外基质匀浆,低剂量药物组、高剂量药物组膝关节腔分别注射含50,100μg氧化苦参碱的脱细胞软骨细胞外基质匀浆。注射4周后取材进行相关检测。结果与结论:①与假手术组比较,骨关节炎组关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛水平升高(P<0.05),超氧化物歧化酶水平降低(P<0.05);与骨关节炎组比较,低剂量药物组、高剂量药物组关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛水平降低(P<0.05),超氧化物歧化酶水平升高(P<0.05),其中高剂量药物组变化更显著。②Tunel染色显示,与假手术组相比,骨关节炎组凋亡软骨细胞增多;与骨关节炎组相比,单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组凋亡软骨细胞减少,其中高剂量药物组减少更显著。③苏木精-伊红与免疫组化染色显示,骨关节炎组大鼠膝关节软骨严重退变,软骨组织中Ⅱ型胶原表达降低(P<0.05)、基质金属蛋白酶9表达升高(P<0.05);与骨关节炎组相比,单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组大鼠膝关节软骨退变明显改善,软骨组织中Ⅱ型胶原表达升高(P<0.05)、基质金属蛋白酶9表达降低(P<0.05),其中高剂量药物组改善最显著。④Western blot检测显示,与假手术组相比,骨关节炎组软骨组织中Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达升高(P<0.05);与骨关节炎组相比,低剂量药物组、高剂量药物组Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05),Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达降低(P<0.05),其中高剂量药物组改善更显著。⑤结果表明,膝关节腔内联合注射脱细胞软骨细胞外基质与氧化苦参碱可通过促进细胞外基质的合成、抑制炎症与氧化应激反应、抑制软骨细胞凋亡发挥骨关节炎治疗作用,该治疗作用可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。

脱细胞细胞外基质及其预构建桥接物修复坐骨神经缺损的实验研究

目的比较脱细胞细胞外基质(acellularextracellularmatris,AECM)同周围神经并行端侧吻合预构建桥接物修复坐骨神经缺损并与自体神经移植后神经再生的效果比较,探讨其修复长段周围神经缺损的可行性。方法将组织工程化技术制备的AECM10mm、15mm、20mm预构建,形成一种新的神经桥接物并对其进行了观察和动物移植试验。预构建即将AECM与坐骨神经并行端侧吻合2周。结果发现组织工程化技术制备的AECM虽然细胞被完全消蚀,但还具备原有三维结构及生物活性,经预构建后用其修复SD大鼠15mm坐骨神经缺损时,取得了接近自体神经移植的结果,并且没有缺血或炎性表现,无瘢痕形成。结论这种新的AECM预构建桥接物有可能成为自体神经移植的替代材料。

牛松质骨脱细胞骨细胞外基质的制备

为寻找适合骨移植的骨组织替代物-脱细胞骨细胞外基质(Acellular bone extracellular matrix,ABECM)制备最佳方法。方法:根据析因设计原理用不同浓度曲拉通X-100液分别与高渗和低渗液联合后对牛肱骨上端松质骨组织进行适当的脱细胞处理,制成脱细胞牛松质骨,再进行HE染色,Massion染色及扫描电镜观察,寻求最佳的曲拉通X-100的浓度,脱细胞时间及最佳的制备脱细胞牛松质骨的方法。结果表明:10%氯化钠与0.5%曲拉通X-100联合处理48小时的脱细胞牛松质骨未见细胞成分,细胞外基质基本结构未被破坏。由此可见本方法可以成功的制备ABECM,曲拉通X-100是制备ABECM良好试剂,ABECM是一种新型的理想的骨替代物,有广泛的应用前景。

猪长骨脱细胞骨细胞外基质的制备及生物力学、组织学性质的初步检测

目的 寻找适合骨移植的骨组织替代物—骨脱细胞细胞外基质 (ABECM )。方法 将猪股骨用组织工程学的方法进行适当的脱细胞处理 ,制成ABECM ,再进行HE染色和扫描电镜、透射电镜观察 ,及纵向压缩的生物力学性质的检测。结果 ABECM未见细胞成分 ,细胞外基质基本结构未被破坏 ;ABECM在生物力学性质上与新鲜股骨无明显差异。结论 ABECM是一种新型的理想的骨替代物 。

脱细胞细胞外基质组织补片修补腹壁疝二例

例1女，65岁，维吾尔族，巨大难复性白线疝。病史6年，疝块不能回纳半年，时有隐痛。查体：患者矮胖，站立位脐上见一半球状突出的巨大包块，约30cm×25cm×15cm，质软，轻触痛，表面皮肤明显变薄，可触及肠管，平卧手推包块只能部分还纳，未触及腹壁缺损边缘。CT示疝环约10cm×8cm。患者合并慢支、冠心病、房颤、胆石症、脂肪肝。术前相关检查除外手术禁忌，经改善心肺功能治疗2周后，用脱细胞细胞外基质材料（acellular extracellular matrix，AEM）行疝修补术。

重组骨脱细胞细外基复合Wistar大鼠成骨细胞体外培养的形态学观察

目的新型重组骨脱细胞细胞外基质(REAECM)的制备及其细胞相容性的初步检测,为骨组织工程寻找一种新型的细胞外支架提供实验依据。方法应用体外细胞培养技术,对鼠成骨细胞和REAECM体外进行联合培养1～4周,通过相差显微镜、光镜、电镜观察细胞在材料中的生长情况。结果成骨细胞可以在REAECM上发生良好的黏附、增殖,并且可以长入REAECM的孔隙内。结论REAECM可作为构建组织工程骨的一种较好的支架材料,具有网状孔隙结构;在体外和成骨细胞复合培养时表现出良好的细胞相容性,可以作为一种天然的骨组织替代材料。

脱细胞异体皮肤细胞外基质——医用组织补片在美容外科的应用

目的介绍脱细胞异体皮肤细胞外基质医用组织补片在美容外科中的临床应用经验。方法自2002年3月至2005年10月，应用脱细胞异体皮肤细胞外基质——医用组织补片，对患者不同部位进行填充的美容手术，其中头面部填充于皮下浅筋膜层，唇部、颏部、唇裂合并牙槽裂部填充于皮下深筋膜层或肌肉浅层，隆乳术中用于胸大肌减张。结果本组115例患者经1～27个月随访．1例唇裂合并牙槽裂者因补片填充量不足凹陷未完全矫正；1例鼻唇沟填充者其左侧出现血肿、局部出现硬结，于2个月后将左侧假体取出重新填充，但术后6个月仍有不平整，其余患者均获得良好的美容效果。结论脱细胞异体皮肤细胞外基质医用组织补片可以广泛地应用于美容外科的临床填充术。

骨脱细胞后的有机成分分析

目的 探讨脱细胞骨细胞外基质 (AECM)的制备 ,并对其进行有机成分分析。 方法 采用低渗和除垢剂脱细胞方法制备 AECM。使用 HE、Mallory- Heidenhain氏快速一步法染色和阿利新蓝染色观察形态学改变 ;免疫组织化学检测纤维连接蛋白 (FN)和层连接蛋白 (L N)。 结果 HE、Mallory- Heidenhain氏快速一步法染色后镜下可见AECM胶原纤维排列规则 ,骨陷窝空虚 ;阿利新蓝染色可见 AECM骨陷窝周边染色呈不同程度蓝绿色 ;免疫组织化学染色可见 FN和 L N的抗体染色阳性部位在细胞外基质 (ECM)。 结论 低渗和除垢剂二步法脱细胞是 AECM制备的有效方法。脱细胞过程中去除了细胞成分 ,保留了天然的胶原纤维分布及 ECM主要支架成分蛋白多糖、FN和 L N。

软骨脱细胞基质在软骨再生中应用的研究进展

骨关节炎是一种常见的关节退行性疾病,而软骨损伤通常被认为是不可逆的关节变性早期因素。由于软骨的自我修复和再生能力有限,目前软骨缺损的修复仍是一个具有挑战性的医学难题。近年来,应用组织工程技术治疗软骨缺损被认为是一种新的治疗途径。软骨脱细胞基质(acellular cartilage matrix,ACM)保留了天然软骨的细胞外基质空间结构和生物活性成分,能够最大程度地模拟天然软骨的细胞外环境,是软骨修复与再生的理想材料。ACM的主要组成成分包括胶原蛋白、弹性蛋白、生长因子等,其中Ⅱ型胶原蛋白是透明软骨中的主要类型,在调节软骨组织的机械性能方面发挥重要作用。有研究证实Ⅱ型胶原蛋白、生长因子和低氧微环境分别在促进软骨再生中发挥重要作用。Ⅱ型胶原蛋白可以通过特定的方式诱导细胞聚集和软骨分化;ACM中含有的多种生长因子能够诱导Sox9的表达,促进干细胞成软骨分化;低氧微环境可上调Ⅱ型胶原(COL2A1)、Sox9的表达并维持软骨细胞表型。此外,ACM已被广泛应用于软骨再生的研究,将ACM制备成脱细胞支架、水凝胶或是利用3D生物打印技术对软骨缺损进行修复均取得了良好的软骨再生效果。尽管ACM源性生物材料具有诸多优点,但在实际应用中尚存在一些问题,例如ACM的成分丢失、支架的性能降低等,值得进行深度的探索和挖掘。

3D打印脱细胞的细胞外基质修复软骨缺损的研究进展

局灶性的关节软骨缺损在临床上很常见,会引起长期疼痛、关节功能障碍,甚至进展为骨关节炎。关节软骨组织自我修复能力差,而目前常用的修复方案,如微骨折术、骨软骨镶嵌成形术、自体软骨细胞移植等,均难以生成足量且生物学功能良好的透明软骨,远期效果有限。脱细胞的细胞外基质(dECM)是动态且复杂的三维(3D)微环境,具有优秀的生物力学、生物物理和生物化学特性,可以直接或间接调节细胞行为,包括增殖、黏附、迁移和分化。干细胞来源的dECM更具有低免疫原性、高组织相容性和高分化潜力的优势,且与天然ECM微环境的相似度更高,在组织工程研究中常作为生物支架应用于软骨修复。结合3D生物打印技术,将dECM同其他生物分子甚至细胞组合作为生物墨水,打印生成的生物支架可以重构软骨细胞存活和增殖所需的物理和机械微环境。通过讨论总结dECM的生物学功能、dECM在修复软骨损伤中的作用机制、3D生物打印dECM支架的技术特点,以及现阶段存在的挑战和不足,能够为软骨缺损修复提供新的研究方向。

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。

3D打印制备PLGA/脱细胞软骨细胞外基质支架材料及其理化特性研究

目的采用低温沉积3D打印技术制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]支架,复合脱细胞软骨细胞外基质(decellularized articular cartilage extracellular matrix,DACECM)制备PLGA/DACECM组织工程软骨支架,探讨其理化特性。方法利用低温沉积3D打印技术制备PLGA支架。采用改良式物理、化学脱细胞方法制备DACECM混悬液。利用冷冻干燥和物理化学法交联技术制备DACECM取向支架,同法将DACECM混悬液与PLGA支架复合制备PLGA/DACECM取向支架。通过大体观察、扫描电镜观察3种支架宏观、微观结构,组织学及免疫组织化学染色定性分析DACECM取向支架成分,生物力学试验检测3种支架压缩模量。于SD大鼠皮下包埋3种支架,HE染色观察免疫排斥反应。分离培养新西兰大白兔软骨细胞,制备3种细胞-支架复合物,扫描电镜观察细胞在支架上的生长黏附情况。取鼠L-929成纤维细胞分别于3种支架浸提液进行培养,以DMEM培养液培养细胞作为对照,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖情况。结果大体观察和扫描电镜观察示,PLGA支架表面较光滑,可见大孔;DACECM取向支架表面粗糙,为疏松多孔相互连通的三维立体结构;PLGA/DACECM取向支架表面粗糙,大孔与小孔相互连通,具有垂直三维立体结构。组织学及免疫组织化学定性分析显示,DACECM脱细胞完全,保留了软骨基质的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原蛋白成分。生物力学检测示,DACECM取向支架压缩模量显著低于其余2种支架(P<0.05),PLGA支架和PLGA/DACECM取向支架间差异无统计学意义(P>0.05)。SD大鼠皮下包埋实验示,DACECM取向支架和PLGA/DACECM取向支架的免疫排斥反应明显低于PLGA支架。细胞-支架复合物扫描电镜观察示,软骨细胞在PLGA支架上未见明显黏附,大量软骨细胞在PLGA/DACECM取向支架和DACECM取向支架表面黏附、生长。CCK-8检测示,随培养时间延长,各组细胞数量均呈递增趋势,各时间点组间吸光度(A)值比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 PLGA/DACECM取向支架具有无细胞毒性、优良的理化性能,有望成为一种组织工程软骨支架材料。

应用脱细胞生物材料修补腹壁疝11例报告

复旦大学附属华东医院从2007年3月起尝试应用一种新型的生物材料——脱细胞生物材料（acellular tissue matrix，ACTM）在手术区域细菌污染或感染及植入合成材料后深部感染的情况下完成腹壁疝修补11例，近期疗效满意。报告如下。

Ang-1模拟肽协同血管内皮生长因子对心肌梗死大鼠心脏功能的影响

目的观察心脏细胞外基质(c-ECM)结合胶原靶向血管内皮生长因子(CBD-VEGF)和Ang-1模拟肽(AMP)对心肌梗死大鼠心脏功能的影响。方法对AMP行MTT体外人脐静脉内皮细胞(HUVEC)活性试验及对修饰了Biotin的AMP(Bio-AMP)进行与c-ECM的结合试验。将SD大鼠行左前降支结扎构建心肌梗死模型,然后随机分为PBS组(A组)、c-ECM/CBD-VEGF组(B组)和CBD-VEGF/c-ECM/AMP组(C组),每组4只,分别于梗死部位注射PBS、CBD-VEGF/c-ECM和CBD-VEGF/c-ECM/AMP进行治疗。3个月后采用超声心动图评价3组大鼠的心脏功能,采用免疫荧光染色方法检测3组大鼠心肌梗死区域血管数量、vWF阳性面积比和ZO1阳性面积比。结果MTT试验检测结果显示,AMP和Ang-1具有相似的促进HUVEC增殖的能力;结合实验结果显示,Bio-AMP可以连接在c-ECM上。处理3个月后,C组大鼠术后心脏射血分数(EF)显著高于A组和B组(t=7.794、3.613,P<0.05)。大鼠心肌梗死区域免疫荧光染色显示,C组血管数量和vWF阳性面积比高于A组(t=4.950、22.390,P<0.05),并且C组vWF阳性面积比显著高于B组(t=11.400,P<0.05)。C组和B组的ZO1阳性面积比明显高于A组(t=13.290、4.328,P<0.05),C组的ZO1阳性面积比明显高于B组(t=8.243,P<0.05)。结论将本研究合成的CBD-VEGF/c-ECM/AMP水凝胶注射于大鼠心肌梗死区域后具有促进大鼠心脏功能恢复和促进心肌梗死后血管再生及细胞连接的作用。