脱细胞肌腱片促进兔肩袖损伤腱-骨愈合的实验研究

目的评价犬脱细胞肌腱片(decellularized tendon slices,DTSs)对兔肩袖损伤腱-骨愈合的作用。方法取成年比格犬跟腱经反复冻融5次结合核酸酶处理12 h制备DTSs,体外对DTSs行组织学观察和细胞相容性评价。取成年雄性新西兰大白兔24只,体重2.5～3.0 kg,随机选取一侧肩关节自冈下肌腱止点处纵向作宽大于正常肌腱50%、长为8 mm的U形缺损,用犬DTSs修复冈下肌腱缺损并重建腱-骨止点(实验组);对侧肩关节不作任何处理(对照组)。术后4、8、12周取两组标本行组织学观察和生物力学测试。结果体外组织学观察示犬DTSs胶原结构保留完整,无细胞残留;细胞相容性实验示成纤维细胞与DTSs良好黏附。生物力学测试示,随时间延长,实验组最大载荷和刚度均呈增加趋势,12周时显著高于4周及8周(P<0.05);除12周实验组最大载荷与对照组比较差异无统计学意义(t=0.969,P=0.361)外,其余各时间点实验组最大载荷及刚度均显著小于对照组(P<0.05)。组织学观察示,对照组可见腱-骨止点的4层结构。实验组术后4周腱-骨界面由肉芽组织填充,少量类似Sharpey纤维连接于腱-骨间;随时间延长肉芽组织界面消失,成纤维细胞、Sharpey纤维、新生软骨和软骨细胞数量增多,腱-骨界面逐渐成熟,但未见位于矿化纤维软骨与非矿化纤维软骨间的潮线。结论经反复冻融5次结合核酸酶处理12 h制备的犬DTSs可促进兔肩袖损伤腱-骨愈合,提高肩袖损伤修复的生物力学性能。

移行结构化细胞-肌腱复合物重建韧带-骨连接体的实验研究

目的观察体外构建的具有连续异质性移行结构的细胞-肌腱复合物重建兔前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)在动物体内的愈合效果。方法通过胶原水凝胶将异质性细胞群种植于脱细胞兔跟腱支架内特定的区域,构建一种具有纤维形成、软骨形成及骨形成3个功能区域的细胞-肌腱复合物重建兔ACL,8周后进行组织学、显微CT、免疫荧光分析检测移植物与骨隧道间预先设定区域内特定组织的梯度形成情况。结果组织学及免疫荧光结果显示,软骨标志物GAG、COL2A1只在软骨段内生成,而骨标志物钙结节、OCN只在成骨段内生成,关节腔内纤维生成段内新生的胶原纤维相互连接,有效地修复了支架的胶原结构。显微CT结果显示,与对照组相比,实验组骨隧道腔内大量新生矿化组织形成。该细胞-肌腱复合物重建兔ACL 8周后,在骨隧道-关节腔界面表现出纤维-纤维软骨-骨的结构渐变现象。结论该细胞-肌腱复合物重建兔ACL,骨隧道-肌腱界面愈合良好,微观结构与生理性ACL-骨界面极其相似,有望应用于ACL的损伤后重建。

脱细胞小牛肌腱组织形态学和生物力学特性研究

目的研究反复冻融结合核酸酶处理小牛肌腱脱细胞效果以及对肌腱组织形态、结构、生化成分和力学特性的影响。方法取新鲜1日龄西门塔尔小牛跟腱48根,随机分为3组(n=16):A组为正常对照组,B组采用液氮冷冻/37℃复温反复冻融5次,C组在反复冻融基础上结合核酸酶处理24 h。每组取2根跟腱用于扫描电镜观察,3根用于、组织学及免疫组织化学染色观察,3根用于DNA残留量检测,8根用于生物力学检测。结果扫描电镜观察示A、B组胶原纤维排列致密有序,形态完整,未见断裂;C组胶原纤维排列松散,几乎无断裂。阿利新蓝、天狼星红染色及免疫组织化学染色示C组糖胺聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白大部分被保留;HE染色和DAPI染色示A、B组胶原纤维间可见较多完整的细胞核,而C组胶原纤维之间未见完整细胞核,但腱内膜上仍有部分细胞核残留。A、B、C组的DNA残留量分别为(0.24±0.12)、(0.16±0.07)、(0.05±0.02)μg/mg,C组显著低于A、B组(P<0.05);A、B组间差异无统计学意义(P>0.05)。生物力学检测显示,A、B、C组间拉伸强度、断裂应变、刚度和弹性模量差异均无统计学意义(P>0.05)。结论反复冻融结合核酸酶处理小牛肌腱,可有效去除细胞成分,同时基本保留肌腱原始胶原纤维结构、形态、大部分细胞外基质成分和力学特性。