脱细胞脊髓天然支架的制备及形态学观察

[目的]采用化学脱细胞方法去除细胞和髓鞘成分制作细胞外基质支架,为桥接脊髓损伤缺损提供理想的天然神经支架。[方法]取SD大鼠胸段脊髓约2cm,运用冻融+化学萃取(3%脱氧胆酸钠和1KU/mlDNaseI、RNaseA)的组织工程学方法处理大鼠脊髓组织,并对处理后的脊髓支架分别进行组织学检查,了解脱细胞情况及细胞外基质支架形态。[结果]经过脱细胞处理后,光镜下HE染色脊髓横断面呈网状结构,未见细胞成分存留,纵切面上呈互相交错的管状通路;未见轴突、髓鞘和细胞核。髓鞘染色可见髓鞘脱除彻底,未见髓鞘成分。[结论]本实验采用冻融+化学萃取的组织工程学方法可制备出理想的天然脊髓支架,该支架与脊髓三维组织结构具有高度相似性,有望作为脊髓损伤后桥接物和神经组织工程种子细胞的支架,本实验结果显示3%脱氧胆酸钠和1KU/mlDNa-seI、RNaseA进行脱细胞处理两次是较为合适的,能较为彻底去除细胞及髓鞘成分并较为完整地保留细胞外基质的三维结构。

脱细胞脊髓支架的成分分析

目的探讨同种异体脱细胞脊髓支架的制备方法并分析其可能含有的有效成分。方法采用冻融+化学萃取方法制备脱细胞脊髓支架,光镜及扫描电镜观察其结构特征;用免疫组织化学法分析脱细胞支架的主要成分。结果正常的大鼠脊髓组织经脱细胞处理后,清除了所有的细胞成分及髓鞘和轴突,扫描电镜显示保存了细胞外基质成分构成了三维支架结构。成分分析结果显示,存留的支架结构中含有层黏连蛋白(laminin,LN)、纤连蛋白(fibronectin,FN)、Ⅳ型胶原等诱导和促进神经再生、促进细胞黏附和增殖的重要成分。结论脱细胞异体脊髓具有三维支架结构,含有诱导和促进神经再生的相关蛋白,有利于受损神经的再生及移植细胞的存活和增殖。

京尼平交联对大鼠脱细胞脊髓生物学特性的影响

目的探讨新型生物交联剂京尼平对大鼠脱细胞脊髓生物学特性的影响。方法从成年SD大鼠(体质量200～250 g,雌雄不限)获取大鼠胸段脊髓,采用化学萃取法对大鼠脊髓组织进行脱细胞处理,再用生物交联剂京尼平(5 g/L)进行化学交联。分别采用HE染色和扫描电镜观察京尼平交联前后脱细胞脊髓的微观结构,并进行孔径大小、交联率、含水量、在PBS溶液及胰酶溶液中的稳定性能检测,再将大鼠骨髓间充质干细胞分别与京尼平交联前后的脱细胞脊髓浸提液共培养,采用MTT法在体外评估该支架材料交联前后的细胞毒性情况。结果京尼平交联前后的脱细胞脊髓拥有类似的多孔结构,孔径大小约30μm,最终交联率可达90%,交联后的脱细胞脊髓含水率从(283.4±11.2)%降至(229.7±12.5)%,但其在PBS及胰蛋白酶中的稳定性得到了明显的增强。交联前后的脱细胞脊髓都未观察到明显的细胞毒性。结论京尼平交联的脱细胞脊髓部分生物学特性得到改善,为应用于脊髓损伤修复的组织工程材料提供了一种新的选择。

2种去细胞方法制备大鼠脱细胞脊髓支架效果的对比研究

目的比较脱氧胆酸钠+Triton X-100和脱氧胆酸钠+DNA+RNA酶2种脱细胞方法制备脱细胞的同种异体脊髓支架的效果。方法取成年SD大鼠胸段脊髓2 cm,运用冻融+化学萃取的组织工程学方法(脱氧胆酸钠+Triton X-100和脱氧胆酸钠+DNA+RNA酶)处理大鼠脊髓组织,对处理后的脊髓支架分别进行HE染色,髓鞘染色和扫描电镜观察。结果2种方法均较为完全地脱去了细胞和髓鞘成分,脊髓横断面上呈网状结构,未见细胞成分存留,纵切面上呈互相交错的管状通路;未见轴突、髓鞘和细胞核。结论采用冻融+化学萃取的2种组织工程学方法均可制备出理想的天然脊髓支架,该支架与脊髓三维组织结构具有高度相似性,有望作为脊髓损伤后桥接物和神经组织工程种子细胞的支架。

脱细胞脊髓基质支架的制备及生物特性

背景:以脱细胞脊髓基质材料为构架的脊髓生物支架,已被证实可恢复或部分恢复受损的脊髓神经功能。目的:介绍脱细胞脊髓基质支架的制备方法和部分生物特性,对近年来其在脊髓组织工程中的应用及进展作一概述。方法:应用计算机检索CNKI和PubM ed数据库中2005年1月至2014年10月关于脱细胞脊髓基质支架材料在脊髓损伤中应用的文章,在主题和摘要中,中文以"脱细胞脊髓,支架材料,脊髓损伤,组织工程学"为检索词检索,英文以"acellular spinal cord;engineering tissue;spinal cord injury;scaffold"为检索词进行检索。结果与结论:脱细胞脊髓基质支架具有较低的抗原性、优良的生物相容性及类似脊髓的三维支架结构,但存在力学性能差及结构不稳定等缺点。通过京尼平、戊二醛等交联剂改性后可明显提高支架的生物性能。目前国内外已对脱细胞脊髓基质支架在神经修复再生方面的应用做了一些探索,为脊髓组织工程学打下了基础。由于脱细胞脊髓基质支架的诸多优点,脱细胞脊髓基质材料有望成为脊髓组织工程学的理想材料。

大鼠骨髓间充质干细胞与脱细胞脊髓支架体外共培养

目的评价脱细胞脊髓支架在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养中的作用,探索最佳接种浓度。方法分离、培养及鉴定SD大鼠BMSCs,诱导BMSCs向神经元样细胞分化。制备脱细胞脊髓支架,将第3代BMSCs同脱细胞脊髓支架共培养,MTT法检测细胞增殖活性,比较与普通培养的差异;取第3代BMSCs以不同浓度[(0.5、1、2、3、4)×106/mL]接种于支架(脊髓支架修整0.5cm小段),检测细胞在支架上的粘附率及上架细胞数,建立接种浓度与细胞粘附率、上架细胞数的关系回归方程;扫描电镜观察脱细胞脊髓支架形态以及细胞与支架的粘附情况。结果成功实现BMSCs的分离及培养,BMSCs流式鉴定CD29、CD90阳性表达,向神经元诱导胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)呈阳性表达;与普通培养相比,BMSCs在支架上细胞增殖活力显著提高(P<0.05);细胞与支架的粘附率在接种浓度为2×106/mL最高,达到(79.6±2.7)%,单位体积上架细胞数达到(1.364±0.047)×106/cm3;扫描电镜观察支架空间结构良好,细胞与支架粘附良好,共培养第3天较第1天细胞数量明显增加。结论脱细胞脊髓支架具有多通道的空间结构,适合BMSCs粘附、存活、增殖,该支架是良好的天然脊髓组织工程材料。当粘附率及细胞上架数基本达到最大时的最佳接种浓度为2×106/mL。

脱细胞脊髓基质支架的研究进展

应用组织工程学技术进行脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的修复已成为神经医学领域内的研究热点。支架构建作为组织工程学研究的基本要素,在进行组织水平的脊髓重构研究中具有极其重要的意义。如何构建符合脊髓组织解剖和生理需要的组织工程脊髓支架,

大鼠脱细胞脊髓的形态学观察

目的:观察大鼠脱细胞脊髓的形态特点,探讨其作为脊髓组织工程支架的可行性。方法:取11条SD大鼠脊髓,采用冻融+化学萃取法进行脱细胞处理,其中2条采用HE染色观察脱细胞情况,立春红2R-亮绿SF染色观察脱髓鞘情况;3条取颈、胸、腰段横切片行Mallory三色胶原染色和透射电镜检查,3条取颈、胸、腰段纵切片行Mallory三色胶原染色,3条取颈、胸、腰段贴片行扫描电镜检查,观察其形态构成等参数,比较不同部位材料内部结构的差异。结果:经脱细胞处理的脊髓呈乳白色扁长条状,干燥,体积较处理前略变小,韧性及强度增加,表面脊膜包裹完好,无异味。HE染色显示脊髓内未见细胞残留;丽春红2R-亮绿SF染色证实神经细胞轴突脱髓鞘完全。颈、胸及腰段脊髓横断面均呈网格状结构,纵断面均呈平行管状结构。颈、胸及腰段横断面网格大小及纵断面平行管状结构间距行统计学两两比较,颈段网格长径明显大于胸段(P<0.05),胸段网格短径明显小于腰段(P=0.05),其余均无统计学差异(P>0.05)。结论:SD大鼠脊髓经脱细胞处理后颈、胸和腰段脱细胞彻底,保留了原脊髓的主体结构,可作为脊髓组织工程的支架。

大鼠脱细胞异体脊髓支架的免疫原性研究

[目的]评价脱细胞脊髓支架的免疫原性,为其在组织工程中的应用奠定理论基础。[方法]将脱细胞脊髓(冻融+3%脱氧胆酸钠+DNase,RNase消化)及新鲜大鼠脊髓分别植入SD大鼠椎旁肌内,于术后1～4周分别取材进行组织学观察,通过HE染色评价炎症反应程度;应用免疫组织化学方法观察移植物及周围组织中的CD3、CD4和CD8阳性T细胞浸润程度,评价免疫排斥反应强度。[结果]组织学观察显示术后均引起周围组织炎症反应,脱细胞组术后1周可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润,但2周后只有少量淋巴细胞浸润;新鲜异体脊髓移植组术后1周可见大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润,术后4周仍有大量淋巴细胞浸润;与新鲜异体脊髓移植比较,化学去细胞异体脊髓植入后免疫原性明显降低,但仍有轻度细胞介导的免疫反应存在。[结论]移植经化学去细胞处理的异体脊髓后,仅引起轻微的炎症反应和免疫排斥反应,具有良好的组织相容性,并有可能成为良好的脊髓组织工程替代材料。

超声辅助脱细胞脊髓支架的生物学特性研究

目的采用超声振荡结合化学萃取法制备大鼠脱细胞脊髓支架，观察其三维结构及生物学特性，为脊髓组织工程研究提供理想的支架材料。方法采用超声振荡结合化学萃取（体积分数2％TritonX-100＋体积分数2％脱氧胆酸钠）方法对大鼠脊髓进行脱细胞处理（脱细胞脊髓组），对照正常大鼠脊髓组织（对照组），观察该脱细胞脊髓支架的大体形态、组织学及超微三维结构特点，并检测该支架材料的孔径大小、孔隙率、含水率、酶解率、在水溶液中稳定性等。结果脱细胞脊髓组原有的细胞成分被有效去除，具有（94．57±3．45）％的孔隙率和（88．62±1．0）％的含水率以及良好的三维空间结构（平均孔径为46μm），该支架在胰酶溶液中逐步降解，在第20小时达到（69．03±2．19）％，在双蒸水中逐步崩解，在第8天可达（62．55±1．70）％。正常脊髓组织结构紧密，含大量神经细胞及髓鞘，孔隙率和含水量分别为（0．04±0．02）％、（62．4±1．5）％，扫描电镜下未见明显孔隙结构，该支架在胰酶溶液中逐步降解，在第20小时达到（37．62±0．99）％，在双蒸水中逐步崩解，在第8天可达（40．97±0．81）％。结论超声振荡＋化学萃取所制备的脱细胞脊髓支架细胞成分去除彻底，细胞外基质成分保存完整，具有良好三维空间网状结构、良好的孔隙率和含水量，符合组织工程脊髓支架的理论要求，为组织工程脊髓支架提供理想的选择。

京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的制备及其生物力学特性研究

目的 构建京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架,探讨京尼平交联改性对大鼠脱细胞脊髓支架抗酶解能力、生物力学性能及细胞毒性的影响. 方法 采用化学萃取法制备大鼠脱细胞脊髓支架,再用5 g/L京尼平溶液进行化学交联改性.采用HE染色及扫描电镜观察未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的微观结构,测量基质孔径大小.分别检测交联前后大鼠脱细胞脊髓支架的孔隙率、含水率以及在2.5 g/L胰酶溶液中的失重率.在Instron生物力学测试仪上检测正常大鼠胸段脊髓、未交联及京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架的极限牵张应力和弹性模量.将大鼠骨髓间充质干细胞分别在未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架浸提液中培养,采用MTT法检测细胞相对生长率,评价支架的细胞毒性. 结果 未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架拥有相似的三维网状孔隙结构,孔径大小约30 μm,孔隙率超过80％,两组间差异无统计学意义（P＞0.05）；京尼平交联支架的含水率为（229.7±12.5）％,显著低于未交联支架的（283.4±11.2）％（P＜0.05）；京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架在胰酶溶液中各时相点的失重率明显低于未交联支架（P＜0.05）,生物力学测试其极限牵张应力和弹性模量则显著增强（P＜0.05）；未交联和京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架均未观察到明显的细胞毒性. 结论 京尼平交联大鼠脱细胞脊髓支架拥有与未交联支架相似的结构,但生物力学性能和抗酶解能力明显增强,且无明显细胞毒性,在脊髓损伤修复的组织工程研究中具有良好的应用前景.

脱细胞脊髓支架生物安全性的体外研究

目的 对脱细胞脊髓支架生物安全性进行评价,从而为桥接脊髓损伤缺损提供理想的天然神经支架提供理论基础. 方法 取SD大鼠胸段脊髓约2 cm,运用冻融＋化学萃取（30 g/L脱氧胆酸钠和1 kU/ml DNaseI、RNaseA）的组织工程学方法处理大鼠脊髓组织,对处理后的脊髓支架进行大体观察及组织学检查,了解脱细胞情况及细胞外基质支架形态,并按有关标准制备材料浸提液,对脱细胞支架进行生物安全性评价. 结果 经过脱细胞处理后,光镜下HE染色脊髓横断面呈网状结构,未见细胞存在,纵切面上呈互相交错的管状通路;未见轴突、髓鞘和细胞核.全身毒性试验、热原试验、溶血试验及细胞毒性试验均符合材料标准. 结论脱细胞脊髓支架作为一种新型脊髓组织工程支架材料,具有良好的生物安全性.

脊髓脱细胞支架对大鼠脊髓缺损修复的影响

目的用振荡法制备脊髓脱细胞支架修复同种异体大鼠脊髓缺损,观察术后大鼠行为学及组织再生情况。为脊髓缺损后修复提供新的研究思路。方法将30只SD大鼠脊髓分别用50 ml 3%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)和2%脱氧胆酸钠溶液在摇床上做振荡处理,对比处理前后细胞残留情况及组织的空间结构,了解支架本身的组织构成。将90只SD大鼠随机分成空白对照组、单纯脊髓缺损组和支架移植组。切除单纯脊髓缺损组和支架移植组大鼠腰椎9~10节段,移植脱细胞支架至支架移植组大鼠。术后饲养12周,期间进行行为学评分观察,分别在4、8及12周时取大鼠损伤部位的脊髓进行HE染色及神经再生相关蛋白免疫荧光检测。结果通过HE、Masson、甲苯胺蓝染色显示,脱细胞处理后的脊髓脱细胞支架上神经细胞及轴突彻底清除,保留了脊髓细胞外基质。扫描电子显微镜观察发现,支架保留一定多孔网状支架结构。脱细胞支架在体实验中,Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分显示,移植有脱细胞支架的大鼠后肢运动功能恢复优于单纯损伤组大鼠。组织学HE染色显示,脱细胞支架能够填补缺损的脊髓节段,加快损伤脊髓的修复过程。免疫荧光显示,支架移植组大鼠的损伤部位有一定轴突再生。结论脊髓脱细胞支架保留了细胞外基质并具有一定空间结构,能够一定程度加快脊髓缺损修复,对神经再生具有一定的促进作用。

EDC交联结合化学萃取制备脱细胞脊髓支架及其生物学特性研究

[目的]采用EDC(碳化二亚胺)交联结合化学萃取法制备脱细胞脊髓支架,探讨脱细胞脊髓支架制备效率,分析支架的生物学特性,观察支架能否保留细胞外基质黏多糖成分。[方法]采用EDC交联结合化学萃取法(液氮结合42℃恒温水浴反复冻融6次+1%Triton X-100+1%脱氧胆酸钠+EDC交联+液氮结合42℃恒温水浴反复冻融6次+1%Triton X-100+1%脱氧胆酸钠)处理正常脊髓20根,得到脱细胞脊髓支架(支架组);对照于正常大鼠脊髓组织(对照组)。通过HE染色检验支架组脱细胞效果,统计脱细胞脊髓支架的等级评分"优"、"良"、"一般"、"差"的百分比;选取HE染色脱细胞彻底、评分为"优"的脊髓支架,DAPI染色验证其内部细胞残留情况的等级评分是否一致为"优";通过电镜扫描观察两组内部三维结构并分析其孔径;分析脊髓组织脱细胞处理前后的含水率、孔隙率、抗酶解性的变化;通过免疫组化的方法,观察两组材料细胞外基质中黏多糖分布情况。[结果]支架组通过HE染色观察到脱细胞彻底、评分为"优"的百分比为80%;HE染色观察评分为"优"支架经DAPI染色验证其内部细胞残留量评分也为"优";其三维结构完整,其孔径均值为9.07μm;含水率为(228.14±19.39)%;孔隙率为(71.82±2.10)%;在胰酶中,第20 h的酶解率平均为(35.904±1.911)%;免疫组化分析鉴定细胞外基质中包含一定的黏多糖。对照组中正常脊髓经HE染色和DAPI染色观察到大量细胞;三维网孔状结构,孔径均值为40.7μm;含水率和孔隙率分别为(109.32±12.44)%和(61.18±4.19)%;在胰酶中,第20 h的酶解率平均为(25.704±1.030)%;细胞外基质中包含大量的黏多糖成分。[结论]EDC交联结合化学萃取法制备的支架脱细胞彻底、制备效率高,具有三维网状结构、良好的含水率、空隙率、抗酶解性,一定程度上保留细胞外基质中黏多糖成分,符合组织工程学支架制备要求,为脊髓支架提供了一种新的选择。

神经干细胞与脊髓脱细胞支架体外共培养的可行性

目的观察大鼠神经干细胞(NSCs)在脊髓脱细胞支架(SCAS)上黏附、生长和分化情况,评价其构建脊髓组织工程的可行性。方法新生Sprague-Dawley大鼠大脑皮质来源NSCs传代培养并鉴定;Sprague-Dawley雌性大鼠脊髓组织改良物理振荡结合化学萃取法制备SCAS,并行基础评估;将第三代NSCs种植在SCAS上,体外共培养,免疫荧光、免疫组化和扫描电镜观察支架上细胞形态。结果共培养的细胞为能增殖、分化的NSCs。制备的SCAS孔隙率、含水率、酶解率都明显高于正常脊髓(|t|>4.679,P<0.01);SCAS基质结构呈疏松网络状,基质上可见极少量残留细胞核。NSCs在SCAS上黏附、生长良好,可分化为神经元和神经胶质细胞。结论制备的SCAS脱细胞较彻底,具有多通道空间结构,适合NSCs黏附、生长和分化,可用于脊髓组织工程。