不同细胞浓度种植于脱细胞血管基质上的细胞生长方式(英文)

背景:对于组织工程血管而言,如何在平滑肌细胞层上成功获得致密的内皮细胞层是最为关键的。目的:探索不同细胞种植浓度对构建全生物化组织工程血管的影响。方法:先将不同浓度(5×105,5×107L-1)猪血管平滑肌细胞种植在猪脱细胞血管基质上,培养3d后再将不同浓度(5×105,5×107L-1)内皮祖细胞接种在平滑肌细胞-血管基质复合体上,构建片状全生物化组织工程材料。结果与结论:高浓度与低浓度平滑肌细胞在脱细胞血管基质上的细胞生长曲线相似,并且种植在孔板上和在脱细胞基质上的生长曲线亦相似,但低浓度组增殖较慢,覆盖率较低。细胞覆盖率由高到低的顺序为:高浓度内皮祖细胞+含高浓度平滑肌细胞的脱细胞基质>高浓度内皮祖细胞+含低浓度平滑肌细胞的脱细胞基质>低浓度内皮祖细胞+含高浓度平滑肌细胞的脱细胞基质>低浓度内皮祖细胞+含低浓度平滑肌细胞的脱细胞基质,且高浓度内皮祖细胞在脱细胞基质上可形成较为致密的细胞层,呈现出铺路石样生长方式。说明提高细胞接种浓度有利于其在材料表面快速形成致密的细胞层。

不同浓度细胞种植脱细胞血管基质上构建组织工程血管

背景:前期研究表明制备的脱细胞血管基质适合平滑肌细胞和内皮祖细胞生长,但是共培养模型中细胞接种密度对血管基质上细胞覆盖率的影响尚不清楚。目的:观察不同浓度度细胞种植在脱细胞血管基质上的生长情况。方法:采用两步法进行细胞种植,先将不同细胞浓度血管平滑肌细胞种植在脱细胞血管基质上,培养3d后再将不同浓度内皮祖细胞接种在平滑肌细胞-血管基质复合体上,构建片状组织工程材料,分别在内皮祖细胞种植后3d、1周时间段获取标本,扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况。结果与结论:血管平滑肌细胞和内皮祖细胞在脱细胞基质表面生长良好。不同浓度细胞在基质上的排布不同;提高接种的浓度有利于在材料表面快速形成致密的细胞层。提示采用两步法以合适的浓度种植细胞于脱细胞基质上,可以构建组织工程血管。

脱细胞血管基质制备及体内外生物相容性

背景:利用脱细胞血管基质作为血管支架具有以下优点:脱细胞血管基质保留了自然血管的复杂三维结构;脱细胞基质表面的生长因子和结构域有利于细胞的黏附和浸润。目的:制备脱细胞血管基质并对其体内外生物相容性进行评价。方法:采用胰蛋白酶、Triton X-100逐步处理猪颈动脉制备脱细胞血管基质。采用皮下植入实验、急性毒性实验和体外细胞毒性实验等评价其生物相容性。结果与结论:脱细胞基质材料具有良好的化学稳定性,未释放对红细胞产生破坏溶解作用的有害元素,未引起急性溶血反应,对细胞的生长无毒性影响。脱细胞基质材料在动物体内植入后早期有较多炎性细胞浸润,到实验观察的后期无明显炎性细胞浸润,脱细胞基质内可见成纤维细胞。另外,脱细胞基质材料对周边组织未产生毒性作用,伤口Ⅰ期愈合。同时组织学切片显示:支架材料与周边组织相容性好,未产生排斥反应。说明脱细胞基质材料在动物体内具有很好的生物相容性。

不同方法制备脱细胞血管基质的比较

目的筛选理想的脱细胞方法,制备符合组织工程要求的脱细胞血管基质。方法应用三种不同的脱细胞方法[1%TritonX-100+1%十二烷基硫酸钠(SDS)、1%SDS+0.25%胰蛋白酶+1%糜蛋白酶、1%TritonX-100+0.1%氢氧化铵+0.25%胰蛋白酶]脱除猪颈动脉细胞成分,对其进行组织学切片、扫描电镜检测判断脱细胞效果;比较脱细胞前后动脉管道的爆破压变化;测定脱细胞基质的孔径、孔隙率。结果经1%SDS+0.25%胰蛋白酶+1%糜蛋白酶处理后的脱细胞血管基质的细胞成分被完全清除;爆破压强度(1489.33±106.04)mmHg;孔径(140.00±57.73)μm;孔隙率91.22%。结论应用1%SDS+0.25%胰蛋白酶+1%糜蛋白酶顺序处理后得到的脱细胞血管基质适合用于组织工程血管的制备。

羊颈动脉脱细胞血管基质的制备及其生物相容性评价

目的研究脱细胞血管基质快速高效的制备方法并对其进行生物相容性评价,为组织工程血管的研究寻找合适的支架材料。方法取20根长50mm新鲜山羊颈动脉经-80℃冷冻、37℃水浴复温,反复冻融3次,在506MPa、4℃条件下超高压处理20min,0.125%SDS中37℃振摇(100r/min)12h,彻底去除细胞后,行HE染色、Masson染色、扫描电镜观察及生物力学测定研究其组织结构的变化;Hoechst33258荧光染色和细胞DNA残留量分析评价脱细胞效果;通过接触细胞毒性实验、MTT活性测试及皮下埋植实验对制备的脱细胞血管基质进行生物相容性分析。皮下埋植实验取清洁级SD大鼠10只,体重200～230g,分为2组(n=5),实验组于大鼠背部皮下埋植结合物理化学方法处理的脱细胞血管基质,对照组埋植单纯物理方法处理的脱细胞血管基质,分别于术后1、2、3、4、8周取出行HE染色观察。结果 HE染色及Masson染色显示脱细胞血管基质无细胞成分残留,保持较完整的胶原成分;扫描电镜观察血管表面以胶原为主,适合细胞黏附;Hoechst33258荧光染色脱细胞血管基质材料未见明显阳性核染色;苯酚-氯仿提取脱细胞血管基质残留DNA含量,电泳检测分析显示其中DNA含量较正常血管显著降低;生物力学检测示脱细胞血管基质最大荷载时的应力及应变与正常血管比较差异无统计学意义,保持了正常血管的力学特征;接触细胞毒性实验与MTT法测定示脱细胞血管基质与细胞有良好的黏附性,细胞毒性为0～1级;实验组皮下埋植术后8周材料周围基本未见炎性细胞,对照组仍有明显淋巴细胞浸润。结论经反复冻融、超高压及小剂量SDS处理的脱细胞血管基质是一种构建组织工程血管的理想支架材料。

利用同种异体脱细胞血管基质预构小口径血管的研究

目的通过观察狗腹腔内预植同种异体脱细胞血管基质（ACVM）所形成的结缔组织管作为替代血管的力学性能，以及移植于自体股动脉后的组织结构变化，探讨利用同种异体ACVM预构小口径血管的可行性。方法在狗腹腔内埋植长8～12cm用硅胶棒支撑的已制备好的同种异体ACVM，3周后将硅胶棒周围形成的管状物作为血管替代物桥接移植于自体股动脉后，进行力学、组织学检查及与颈动脉、股静脉自体移植的对比分析。于移植术后6个月观测作为替代血管的通畅情况，组织学观察其组织结构变化。结果血管替代物的力学性能弱于正常动脉而强于正常静脉。组织学观察：形成的管状物内腔有少量的间皮细胞黏附；弹性纤维、胶原纤维结构较完整；纤维网中充满成纤维细胞。6个月后内皮细胞在替代物内壁连续覆盖，平滑肌细胞与对照组相近。移植6个月后异体ACVM组血管全部通畅。结论用同种异体ACVM预构的血管替代物，力学性能符合血管移植、血运重建的需求。所形成的结缔组织管作为血管替代物移植6个月后，管壁厚度及组织结构已接近正常血管。

脱细胞真皮基质血管化研究进展

组织创伤及缺损常常导致器官功能障碍和外形破坏，精确的修复重建在未来仍将是一个重大的医疗问题。20世纪90年代，脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix， ADM）首次成功用于皮肤缺损的修复，随后被迅速推广于临床[1，2]。但是ADM仅是一种皮肤替代品，与真正的活体皮肤在结构和功能上有非常大的差异。 ADM移植后可减少瘢痕形成与色素沉着，改善受皮区创面愈合后的柔韧性和弹性。但与自体皮肤移植相比，真皮替代物的血管化进程仍明显偏慢，大大限制了ADM的临床应用。在治疗较大面积的皮肤缺损和深度损伤时，血供问题常常导致治疗失败[3]。因此，早期、快速血管化是ADM在整复外科领域中实现更好发展的保障。本文就ADM的血管化研究现状做一综述。

天然血管基质/聚己内酯复合血管支架的制备与性能表征

将脱细胞血管基质(decellularized vascular matrix,DVM)与聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)相复合,得到的复合支架能保留天然血管基质的血管诱导再生特性,克服降解过快的不足,扩大其在组织工程领域的应用范围。将新鲜的猪主动脉经脱细胞、脱脂等一系列处理后得到DVM粉末,再将其经酶解得到脱细胞血管基质凝胶(decellularized vascular matrix gel,DVMG),将用冰醋酸配置的PCL溶液与DVMG按照不同比例混合,将混合溶液反复包裹模具,室温中冷却后得到不同组的复合血管支架。共制备出4组DVMG/PCL的支架材料,通过扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察发现支架表面较为均匀,截面结构有明显孔隙,利于细胞黏附与迁移。通过力学拉伸实验检测PCL支架、DVMG∶PCL分别为1∶1,1.5∶1,5∶1的各组支架的拉伸模量值依次为49.00±9.52 MPa,46.29±3.08 MPa,38.77±2.07 MPa和31.18±2.80 MPa。体外降解实验显示:4组支架材料均有一定的降解能力,降解速率与DVMG的含量有关,说明改变DVMG与PCL的比例可以制备出不同力学性能、降解性能的复合血管支架。相较于单纯的PCL支架,复合支架中DVMG的含量越高,支架的刚度越低,降解速率越快,DVMG/PCL支架的整体性能得到一定改善。研究结果对于进一步扩大DVM和DVMG的应用范围,改善高分子材料的生物学响应性能具有参考价值。

具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架的制备

目的制备具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架材料,为构建组织工程血管奠定基础。方法用含有脱氧胆酸钠、SDS、EDTA的低渗液和等渗液以及核酸酶对猪的胸主动脉进行脱细胞处理,使用HE、Movat五色法、DAPI染色及电镜观察处理结果。以MTT法分析脱细胞溶液的细胞毒性,通过种植内皮和平滑肌细胞,分析支架的细胞相容性。结果上述方法使用的脱细胞溶液细胞毒性低;经该法处理后,血管的细胞成分完全去除,胶原纤维、弹性纤维、糖蛋白等主要基质成分充分保留,组织结构完整,内皮细胞和平滑肌细胞可以在上面黏附生长,形成完整的细胞层。结论利用脱氧胆酸钠、SDS、EDTA和核酸酶联合消化的方法,可制备出基质成分充分保留、细胞相容性优良的脱细胞血管支架,适于构建组织工程血管。

改良酶学方法获得异种血管脱细胞支架

背景:扩大脱细胞基质的孔径与孔隙率,保证其作为移植物的力学特性,是目前血管组织工程研究的热点之一。目的:观察改良的酶学方法处理异种血管的力学性能和组织相容性。方法:取猪的颈动脉作为基质,采用传统胰蛋白酶-EDTA加1%TritonX-100和0.1%氨水顺序脱细胞方案,并做了适当的方法改进,延长胰酶处理的时间,分别为胰酶处理4h,5h,6h。结果与结论:经组织学分析,脱细胞基质中无细胞成分,脱细胞的支架结构完整,随着胰酶处理时间的延长,其基质内弹力板破坏明显,孔径和孔隙率逐渐增大,缝合强度与爆破强度相对于自然血管虽略有降低,但差异无显著性意义。组织成分胶原蛋白含量也有所下降,尤其胰酶延长至6h组,其胶原蛋白含量明显低于正常未处理的自然血管(P<0.05)。结果显示延长胰蛋白酶处理时间后得到的脱细胞血管基质,具有良好的孔隙率、生物力学性能和组织相容性。

罗格列酮对CD34修饰脱细胞血管支架体内生长的影响

背景:早期研制的脱细胞血管基质支架上预载CD34+抗体会促进其再内皮化,但同时会加重支架内血管内膜增生。国内外研究证实过氧化物酶增殖体受体γ激动剂罗格列酮在体外可抑制平滑肌细胞增生及迁移,可减少血管损伤处内膜增生。目的:进一步验证过氧化物酶增殖体受体γ激动剂罗格列酮对CD34抗体修饰脱细胞血管支架体内移植后平滑肌细胞生长及内膜增生的影响。方法:获取新鲜兔颈动脉,应用光化学偶联法将CD34抗体固定到去细胞光氧化的血管支架上,构建抗体修饰的组织工程血管。将制备的血管分别移植于实验兔的颈动脉上,其中对照组予以移植单纯光氧化处理的脱细胞血管,CD34组予以CD34抗体预载的血管,罗格列酮组移植CD34抗体预载的血管并予喂养罗格列酮。结果与结论:移植后10d:对照组移植血管内皮样细胞数量稀少,CD34组和罗格列酮组可见较多的内皮样细胞覆盖;CD34组血管内膜较罗格列酮组厚,α-SMA染色显示CD34组血管平滑肌细胞数量较后者为多,其差异有显著性意义。移植后30d:CD34组和罗格列酮组血管内皮样细胞基本覆盖管腔全层,对照组内皮样细胞数量仍较少;另外,CD34组血管内膜及管壁中可见大量的平滑肌样细胞及细胞外基质沉积,而罗格列酮组血管结构中平滑肌样细胞数量相对较少,内膜增生亦较轻。提示CD34修饰脱细胞血管支架可促进其内皮细胞的增生,罗格列酮可抑制血管支架中平滑肌细胞的增殖,减少内膜增生。

比较两种兔颈总动脉脱细胞方法

目的:摸索出更简单、高效、实用的制备脱细胞血管基质的方法,并与化学复合酶的脱细胞方法进行比较。方法:应用两种不同的脱细胞方法①0.125%胰蛋白酶+1%Triton+SDS+核酸酶;②超高压+1%糜蛋白酶+核酸酶脱除兔颈动脉细胞成分,对脱细胞后的血管进行DNA含量测定及组织学切片染色(HE、天狼星红),判断脱细胞效果;通过EVG染色、羟脯氨酸含量测定和最终抗张强度测试比较两组血管的机械性能。结果:两组的脱细胞血管基质的细胞成分被完全清除;0.125%胰蛋白酶+1%Triton+SDS+核酸酶组的胶原纤维呈波浪形且有缝隙,而超高压+1%糜蛋白酶+核酸酶组胶原纤维排列致密,组织损失量小;超高压+1%糜蛋白酶+核酸酶组的最大荷重、抗拉强度、弹性纤维及胶原纤维的量均高于对照组(P<0.05)。结论:超高压+1%糜蛋白酶+核酸酶是一种更简单、高效、实用的制备脱细胞血管基质的方法。

组织工程血管支架材料

1可降解性聚乙醇酸血管外支架抑制移植静脉内膜的增生 2不同浓度细胞种植脱细胞血管基质上构建组织工程血管 3应用猪主动脉脱细胞基质制备新型组织工程血管支架：生物相容性及力学性能评价