脱细胞软骨生物支架材料的生物学特性

目的探讨脱细胞软骨生物支架材料(ACM)在细胞毒性、溶血试验、急性全身毒性等方面的生物学特性;方法①ACM的制备:猪膝关节软骨冻干加工为粉末,胰酶消化,曲拉通洗脱,蒸馏水洗净冻干,紫外线照射(UVI)后成型;②细胞毒性测定:材料浸提液培养细胞进行细胞形态大体观察,MTT法观察细胞活性;③急性全身毒性反应:材料浸提液注射入SD大鼠腹腔观察材料对动物表现及体重变化的影响;④溶血试验:材料浸提液与稀释动物鲜血混合观察红细胞溶解情况,492nm下检测OD值计算相对溶血率;结果①细胞毒性试验:24h、48h、72h各时间段内三组细胞OD值两两比较(>0.05),无显著差异,ACM细胞毒性为0级;②动物急性毒性实验:Ⅰ生物材料处理组和Ⅱ生理盐水处理组对动物体重影响没有差异(>0.05),Ⅰ生物材料处理组和Ⅲ苯酚处理组对动物体重有显著差异(<0.05);③溶血试验:材料相对溶血率为2.92%,低于5%的标准,无明显溶血现象;结论ACM在细胞毒性、溶血实验、动物急性毒性反应方面符合软骨组织工程中对于支架材料的要求,提示支架材料有良好的生物相容性和安全性。

医用聚氨酯／脱细胞软骨支架的研制

我们将医用聚氨酯（PU）材料与脱细胞软骨基质生成一种新的PU／脱细胞软骨基质材料，评价该材料是否适合作为软骨组织工程支架。

脱细胞骨软骨支架的细胞相容性测定及与软骨细胞体外的复合

目的测定脱细胞和脱钙处理的脱细胞骨软骨支架的细胞相容性及该支架与软骨细胞体外复合培养的生物学特性和黏附关系,以探讨脱细胞骨软骨支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法采用自制脱细胞骨软骨支架与软骨细胞体外复合培养,用细胞增殖度法测定脱细胞骨软骨支架的细胞相容性,并行电镜观察其相互黏附关系。结果脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好;体外复合实验中,软骨细胞可贴附于材料上生长增殖,并分泌细胞外基质。结论细胞增殖实验显示脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好;体外复合实验显示脱细胞骨软骨支架可与软骨细胞良好复合,适于软骨细胞贴附生长。

脱细胞骨软骨支架的制备及形态学观察

目的:探讨脱细胞骨软骨支架制备的可行性,为关节软骨组织工程提供新的支架材料。方法:3月龄雄性新西兰大白兔,取膝关节髌股关节面的股骨侧,切取4mm×4mm×3mm大小(长×宽×深)骨软骨块,用去垢剂-酶法对骨软骨组织块进行脱细胞脱钙处理,冻干机冻干,制备脱细胞骨软骨支架,并对其进行形态学观察。结果:脱细胞骨软骨支架呈半透明状,弹性良好,组织学评价提示细胞成分已完全祛去,保留了纤维支架。结论:去垢剂-酶法可以祛去骨软骨块中的细胞成分,成为带有空隙的支架材料。

小鼠骨髓基质干细胞与人耳脱细胞软骨复合培养的研究

目的 探讨以小鼠骨髓基质干细胞 (MSCs)作为组织工程软骨的种子细胞 ,在人耳脱细胞软骨支架上生长的可行性。 方法 将人耳软骨经脱细胞处理 ,得到脱细胞软骨支架。抽取鼠的骨髓 ,经离心得到单个核细胞 ,进行体外分离培养得到 MSCs。将鼠的第 2代 MSCs种植于脱细胞软骨支架上 ,体外立体培养 10天 ,在光镜及电镜下观察细胞生长及胶原纤维排列情况。 结果 MSCs在人耳脱细胞软骨支架上能立体培养成活 ,细胞分布不均 ,靠近培养液的一面细胞分布较多 ,其中大部分细胞进入已脱细胞的软骨陷窝内 ,每个陷窝内的细胞数为 1～ 2个。 结论 以鼠 MSCs为种子细胞 ,可在人耳脱细胞软骨支架上良好生长 ,构建组织工程软骨。

聚乳酸/聚乙醇酸与脱细胞软骨粒支架及聚乳酸/聚乙醇酸-脱细胞软骨粒支架体外构建组织工程软骨的比较

背景:聚乳酸/聚乙醇酸具有良好的生物力学性能,但是细胞黏附性较差,而脱细胞软骨基质具有较好的细胞黏附性和亲水性,能介导细胞间信号传导及相互作用,但是生物力学性能不好。课题组制备的聚乳酸/聚乙醇酸-脱细胞软骨基质支架材料,弥补了2种材料各自的缺点,有望成为一种新型支架材料。目的:比较聚乳酸/聚乙醇酸、脱细胞软骨基质、聚乳酸/聚乙醇酸-脱细胞软骨基质3种支架体外构建组织工程软骨的生长情况。设计、时间及地点:对比观察实验,于2008-03/09在山西医科大学实验室完成。材料:聚乳酸/聚乙醇酸平均孔径为100～200μm,孔隙率为94%左右,脱细胞软骨基质支架平均孔径为70～100μm,孔隙率为85%左右,聚乳酸/聚乙醇酸-脱细胞软骨基质平均孔径为100～300μm,孔隙率为90%左右。方法:根据支架材料的不同,实验分为3组,分别为聚乳酸/聚乙醇酸支架组,脱细胞软骨粒支架组,聚乳酸/聚乙醇酸-脱细胞软骨粒支架组,将猪软骨细胞分离、培养、扩增、接种于3种支架,体外联合培养8周。主要观察指标:免疫组化染色检测Ⅱ型胶原表达;反转录-聚合酶链反应检测组织工程软骨细胞内Ⅱ型胶原mRNA含量;Hoechst33258荧光法测定DNA含量。结果:软骨细胞在聚乳酸/聚乙醇酸-脱细胞软骨粒支架组生长良好,8周后仍能维持软骨细胞表型,其分泌Ⅱ型胶原的能力优于其他两组。聚乳酸/聚乙醇酸-脱细胞软骨粒支架组DNA含量、Ⅱ型胶原mRNA含量最高,脱细胞软骨基质组次之,聚乳酸/聚乙醇酸组最低,单因素方差分析显示差异有显著性意义(P<0.01)。结论:聚乳酸/聚乙醇酸-脱细胞软骨粒支架更适于细胞生长、黏附,更有利于维持细胞表型和促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。

ACM复合rBMSC修复兔股骨内髁关节软骨缺损的价值

目的探讨脱细胞软骨支架材料(ACM)复合兔骨髓间充质干细胞(r BMSC)修复兔股骨内髁关节软骨缺损的价值。方法选取48只健康新西兰白兔(3月龄),随机分为3组,ACM-BMSC组,ACM组,空白对照组。各个组再分为6 w和12 w 2个时间段。6 w、12 w时观察修复组织,进行Wakitani组织学评分。结果各个关节腔没有看到感染积液,没有发生关节腔粘连情况。手术后6 w,ACM-BMSC组修复组织多数和周围组织接合较好,ACM组修复组织厚度约2/3,没有看到潮线,空白对照组缺损区没有明显的类软骨组织修复。手术后12 w,ACM-BMSC组修复组织多数是透明软骨样组织,ACM组修复组织表面欠光滑,空白对照组能够看到少量肉芽组织修复。在同一时间段内,不同组间细胞形态、基质染色、表面平整、软骨厚度、接合、总分比较,ACM-BMSC组和空白对照组、ACM组和空白对照组,差异显著(P<0.05);ACM-BMSC组和ACM组无显著差异(P>0.05)。结论经传代后复合脱细胞关节软骨支架材料可以较好地修复兔关节软骨缺损,修复组织中细胞形状、分布和排列与正常软骨组织接近,是关节软骨缺损修复的可选方法。

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。