脱细胞骨基质复合材料的研究进展

切割伤、坠落伤、火器伤等导致的骨缺损患者不断增加,骨修复成为骨科发展研究中的热点问题之一。脱细胞骨基质(aceller bone matrix,ACBM)是对骨组织进行一系列物理和化学操作降低其免疫原性,保留了天然骨组织基本结构,在修复骨缺损的治疗中表现出良好的骨传导性、生物相容性和机械性能。但ACBM不能促进间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化,骨诱导性差,将ACBM与其他类型材料复合,制成具有成骨活性的复合材料,拓展其在骨组织工程中的应用。本文参考国内外文献,将ACBM复合的材料分为有机材料、无机材料、细胞因子组织细胞及多种材料复合四大部分,从临床研究角度分别阐述同ACBM复合形成的新型材料特性、优点、缺点和临床应用价值等,综述了近几年ACBM相关复合支架材料的研究进展。

等离子体处理胶原锚定PLGA/脱细胞骨基质骨软骨双层支架材料的制备和评估

目的:分别以胶原锚定方法修饰的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)为组织工程软骨支架材料,以脱细胞骨基质为组织工程骨支架材料,将二者结合制备出结合良好的组织工程骨软骨双层支架,并观察结构特征,以评估其作为组织工程化骨软骨复合体支架材料的可行性。方法:实验于2006-02/2007-02在解放军总医院骨科研究所完成。①支架的制备:以犬新鲜松质骨为原料,制备脱细胞骨基质作为骨支架材料;将脱细胞骨基质浸于盛有PLGA溶液的模具中,采用固-液相分离法结合致孔剂溶出法制备出多孔的PLGA/脱细胞骨基质双层支架,然后对PLGA支架部分进行等离子体处理和Ⅰ型胶原锚定修饰。得到的新型组织工程骨软骨双层支架的上层为多孔PLGA,下层为脱细胞骨基质。②支架的特征观察:对支架行扫描电镜检测,并采用乙醇置换法测定PLGA层孔隙率,采用北京亚林公司提供的扫描电镜图像分析系统测定PLGA层支架的平均孔径。结果:扫描电镜显示双层支架的PLGA部分具有良好的孔隙贯通结构,孔径为(211±33)μm,孔隙率为(95.0±1.5)%;脱细胞骨基质骨支架部分具有天然骨的孔径和空隙率;PLGA材料渗入骨支架部分,双层支架结合良好。结论:等离子体处理后胶原锚定修饰的PLGA/脱细胞骨基质双层支架具有良好的结构和孔隙率,结合良好,可作为支架载体应用于组织工程骨软骨复合体的构建。

牛脱细胞骨基质的生物力学特性及其黏附性

背景:脱细胞骨基质作为一种天然骨生物衍生材料,应用于骨组织工程支架有着其独特的优越性。目的:观察牛松质骨脱细胞后骨基质的生物力学特性、孔隙率及其黏附特性,探讨其作为组织工程骨天然支架材料的可行性。设计、时间及地点:力学实验采用随机对照观察,于2008-02/06在天津医科大学总医院骨科实验室完成。材料:新鲜牛股骨来自16月龄雄性蒙古牛,体质量350kg;新生24h内SD大鼠3只。方法:利用100g/LNaCl联合1%TritonX-100的方法制备脱细胞骨基质。脱细胞骨基质脱钙切片。利用ElectroForce3200力学试验仪对标本进行压力加载测试。利用新生SD大鼠颅骨传代培养第3代成骨细胞与脱细胞骨基质复合培养12h。空白对照组置于9g/LNaCl溶液。主要观察指标:①苏木精-伊红染色观察骨基质平均空隙直径及空隙率。②观察骨基质弹性强度、破坏载荷、弹性模量。③采用细胞计数法计算两者的黏附率。结果:①利用100g/LNaCl与1%TritonX-100联合可达到良好脱细胞效果,与对照组比较,脱细胞后实验组骨小梁无明显破坏。②所测得牛脱细胞骨细胞外基质空隙直径为(376.33±80.91)μm,空隙率为(70.15±2.98)%。③力学测试此脱细胞方法对骨基质力学特性无显著影响。④脱细胞骨基质与体外培养成骨细胞具有良好的黏附性能,黏附率为62.38%。结论:牛松质骨脱细胞骨基质较完整的去除了细胞的免疫原性,具有良好的骨组织工程支架材料力学性质,接近生理结构的空隙直径及孔隙率,黏附性能满足支架材料的要求。

血管基质成分联合脱细胞骨基质-壳聚糖支架修复桡骨缺损

背景:研究表明,复合使用人工组织工程骨材料和脱细胞骨基质做为骨缺损修复的支架材料,可以综合两者的优点。目的:进一步验证脂肪组织基质血管基质性成分联合脱细胞骨基质壳聚糖支架复合物修复兔桡骨缺损的安全性和生物相容性。方法:取38只新西兰大白兔,其中3只用于脂肪组织血管基质成分的制备,3只用于脱细胞骨基质的制备,32只分为实验组和对照组,采用Brownlow法制备桡骨缺损型,实验组移植血管基质成分-脱细胞骨基质壳聚糖复合支架,对照组造模后不做任何处理。术后2,4个月分别进行一般情况和大体观察、X射线拍照、病理观察、Lane-Sandhu组织学评分。结果与结论:1术后2,4个月2组无感染现象,但实验组的活动量和愈合程度显著性好于对照组;2术后2个月实验组骨缺损部位的X射线影像结果有显著灰白色的高密度影,术后4个月与正常的桡骨骨组织相同,对照组骨不连接;3术后2,4个月实验组病理显示骨组织生长情况显著性的高于对照组,Lane-Sandhu组织学评分显著性的高于对照组(P<0.05);4结果说明,血管基质成分-脱细胞骨基质壳聚糖复合支架修复兔桡骨缺损具有很好的安全性和生物相容性。

碱性成纤维细胞生长因子复合脱细胞骨基质/壳聚糖支架修复骨缺损

背景:有研究显示,碱性成纤维细胞生长因子可促进间充质干细胞的增殖与成骨分化。目的:对比脱细胞骨基质/壳聚糖支架复合碱性成纤维细胞生长因子前后修复兔股骨缺损的能力。方法:采用融合共混与冷冻干燥法制备脱细胞骨基质/壳聚糖支架,采用浸渍法制备碱性成纤维细胞生长因子/脱细胞骨基质/壳聚糖支架。将小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1分别接种于两种支架表面,以单独培养的细胞为对照,进行细胞增殖、细胞黏附与成骨基因检测。在36只6月龄新西兰大白兔双侧股骨远端制备直径5 mm的骨缺损模型,抽签法随机分3组,空白组不进行任何干预,单纯复合支架组、生长因子+复合支架组分别植入脱细胞骨基质/壳聚糖支架与碱性成纤维细胞生长因子/脱细胞骨基质/壳聚糖支架,进行骨缺损部位X射线片与组织学检查。结果与结论:①在培养的1-11 d内,碱性成纤维细胞生长因子/脱细胞骨基质/壳聚糖支架组的细胞增殖快于脱细胞骨基质/壳聚糖支架组(P<0.05),脱细胞骨基质/壳聚糖支架组快于对照组(P<0.05);②细胞与支架共培养4 d后,碱性成纤维细胞生长因子/脱细胞骨基质/壳聚糖支架组培养4,7 d的成骨基因Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥蛋白及Runx2 mRNA表达均高于脱细胞骨基质/壳聚糖支架组(P<0.05),培养7 d后的碱性磷酸酶mRNA表达高于脱细胞骨基质/壳聚糖支架组(P<0.05);③共培养7 d后的扫描电镜显示,两组支架均支持MC3T3-E1细胞的黏附;④动物实验X射线片显示,空白组术后12周时无明显的骨修复;单纯复合支架组术后8周时可见新骨生成,术后12周时可见明显新骨生成;细胞因子+复合支架组术后4周时即可见新骨生成,至术后12周时骨缺损部位几乎完全修复;⑤动物实验术后12周的缺损部位苏木精染色与Masson染色显示,空白组可见大量的纤维组织;两支架组可见大量的新骨生成,其中生长因子+复合支架组的新骨生成面积与成熟度高于单纯复合支架组;⑥结果表明,负载碱性成纤维细胞生长因子的脱细胞骨基质/壳聚糖复合支架是较为理想的骨组织修复材料,可促进骨形成。

脱矿脱细胞骨基质环支架体外构建组织工程化椎间盘纤维环

目的:探计以脱矿脱细胞骨基质环为支架、纤维环细胞为种子细胞体外培养构建组织工程化椎间盘纤维环的可行性。方法:取兔椎间盘纤维环细胞培养,应用甲苯胺蓝染色和Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行鉴定。用纤维蛋白凝胶接种技术将兔椎间盘纤维环细胞接种到经脱矿脱细胞制备的骨基质环支架材料上,体外培养3个月。每月取培养的细胞支架复合体进行大体形态、HE染色光镜检查和扫描电镜观察,并用生化方法检测羟脯氨酸、氨基葡聚糖(GAG)、脱氧核糖核酸(DNA)含量;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ⅰ、Ⅱ型胶原信使核糖核酸(mRNA)表达;免疫组化和蛋白质印迹方法检测Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达。结果:培养的第1代细胞甲苯胺蓝染色呈异染性,Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组化染色均可见阳性表达,表明培养的第1代细胞具有椎间盘纤维环细胞的表型特点。构建的复合体体外培养1、2、3个月时大体呈白色半透明样环状,有光泽,质韧,具有一定弹性,可扭曲;HE染色光镜下见支架孔洞被红染的组织填充,且空洞内的细胞密度逐渐增加;扫描电镜观察材料表面逐渐被组织填充;Ⅰ型、Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性;培养2个月时复合体羟脯氨酸、GAG、DNA含量明显高于1个月时(P<0.01),3个月时与2个月时比较无显著性差异(P>0.05),各时间点复合体羟脯氨酸、GAG、DNA含量均低于正常纤维环(P<0.05或<0.01);培养1个月时复合体可检测到Ⅰ、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达,2个月时与1个月时比较有显著性差异(P<0.01),3个月时与2个月时比较无显著性差异(P>0.05)。结论:以脱矿脱细胞骨基质环为支架、纤维环细胞为种子细胞构建的复合体在体外培养时,细胞能够保持表型特点、逐渐增殖和行使功能,此复合体可被鉴定为类纤维环组织,用其构建组织工程化椎间盘纤维环可行。

新型脱细胞骨基质-壳聚糖骨组织工程支架的制备及性能评价

目的探寻新型脱细胞骨基质(Acellular Bone Extracellular Matrix,ABECM)材料及脱细胞骨基质-壳聚糖(Chitosan,CS)复合多孔支架的制备方法,并对其性能进行评价。方法采用Triton X-100、十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)的脱细胞方法对猪股骨进行脱细胞处理,应用溶液共混、冷冻干燥法制备脱细胞骨基质-壳聚糖复合支架。对ABECM材料进行定性分析,观察ABECM-CS复合多孔支架的形态学、孔隙率、力学性能和细胞-支架复合培养的相容性。结果 ABECM材料HE染色、Hoechest33258荧光染色均无细胞残留,茜素红染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色、骨形态发生蛋白-2抗体染色阳性。扫描电镜显示支架具有多孔结构,孔径50-200μm,孔隙率为(53.50±4.23)%,力学测试支架干燥状态纵向压缩模量为(33.23±14.45)MPa,支架湿润状态下的压缩模量为(2.27±1.13)MPa。细胞-支架复合培养相容性良好。结论制备的ABECM-CS复合多孔支架去细胞彻底,保留了脱细胞骨基质主要成分,具备合适的孔径和孔隙率,细胞相容性良好,是理想的骨组织工程支架。

VEGF在脱细胞骨基质复合富血小板血浆修复颅骨缺损中的表达

目的:研究血管内皮生长因子(VEGF)在脱细胞骨基质(acellular bone matrix,ABM)复合富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)修复兔颅骨缺损时的表达及分布,探讨富血小板血浆促进成骨的机制。方法:雄性新西兰大白兔24只,体质量1.5～2.0kg。在兔颅骨两侧分别建立一个1cm×0.5cm全层骨缺损区,同时去除该区骨膜,注意勿伤及硬脑膜。随机选择一侧骨缺损作实验侧,植入复合PRP的ABM;另一侧为对照侧,仅植入ABM。术后第2、4、8、12周末分别处死6只兔取材。免疫组织化学法测定骨缺损修复区血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达;应用Image-proplus 5.0图像分析软件测量VEGF表达强度的灰度值。采用SSPS16.0软件包进行t检验。结果:术后2周,实验组VEGF呈强阳性表达,随后急剧下降,以后趋于平缓。对照组在术后2、4周呈阳性表达,以后平缓下降。两组相比,在第2、4周时差异均有显著性(P<0.05)。第8、12周时,2组表达差异无显著性。结论:VEGF在实验组早期阶段的强阳性表达,说明血管形成活跃。PRP促进骨修复的作用发生在植入后早期,启动了早期活跃的成骨。

脱细胞骨基质的立体构筑及TritonX-100残留量测定

目的制备骨组织工程的新型天然支架材料。方法取兔双侧胫骨,修整成片状,使用含3%TritonX-100及蛋白酶抑制剂的Tris-HCL的缓冲液洗脱掉骨片中的细胞成份。取脱钙后骨片行HE染色及阿利新蓝染色并用免疫组化方法检测骨片中纤维连接蛋白及层黏连蛋白;Mallory-Heidenhain染色测量骨陷窝形态;对骨片进行扫描电镜及透射电镜观察;使用反相高效液相色谱检测TritonX-100残留量。结果 HE、阿利新蓝染色见脱细胞骨基质胶原纤维排列规则,骨陷窝空虚;骨陷窝形态测量表明脱细胞骨基质的骨陷窝数量与正常骨的骨陷窝数量没有差异;免疫组织化学染色及免疫透射电镜均见纤维连接蛋白与层黏连蛋白存在于脱细胞骨基质和正常骨的骨陷窝周边处;TritonX-100残留量测定表明脱细胞骨基质最低检出极限为0.5μL/mL。结论脱细胞骨基质保持了骨的正常立体构筑,是一种新型的生物衍生材料,具有广阔的应用前景。

版纳小型猪脱细胞骨基质的抗原检测及力学性状

制备版纳小型猪脱细胞骨基质,进行组织学和生物力学观察,并进行了异种抗原-αga l表达的检测,结果表明经脱细胞处理后,去除了骨组织的细胞成分,同时消除了抗原性,力学性质上与正常对照无明显差异,可以作为一种合适的骨组织工程支架材料。

脱细胞骨基质复合富血小板血浆修复颅骨缺损的实验研究

目的研究脱细胞骨基质（ABM）复合富血小板血浆（PRP）修复兔颅骨缺损的可行性及机制。方法雄性新西兰大白兔24只，体质量1．5～2．0kg。在兔颅骨两侧分别建立1cm×0．5cm的全层骨缺损区，去除该区骨膜。随机选择一侧作实验侧，植入复合PRP的ABM；另一侧为对照侧，仅植入ABM。术后第2、4、8、12周分别处死兔6只并取材，观察两侧颅骨缺损修复愈合情况。结果所有实验动物均未发生明显炎症和排异反应。随着时间的延长。两侧颅骨缺损区都有不同程度的成骨，新生骨量呈增加趋势。术后第12周，实验侧ABM颗粒已完全降解，骨髓腔改建完成，缺损区基本达到骨性愈合；对照侧仍有较大的ABM颗粒未降解，缺损中央部位仍有未愈合区域，有骨髓腔形成。结论ABM是良好的骨移植替代材料，PRP具有促进成骨作用，能加速骨缺损的修复。

大块异种脱细胞骨基质的制备及生物相容性研究

目的:探讨大块异种脱细胞骨基质的制备及生物相容性,为其在骨缺损修复领域中的临床应用提供实验依据。方法:取牛股骨下端松质骨切割制作4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm大小的骨块,用10%NaCl和0.5%曲拉通X-100联合脱细胞处理,分为48 h、72 h、96 h三个时间段;处理后的大块异种脱细胞骨基质行HE染色、Masson染色及扫描电镜观察,观察大块异种脱细胞骨基质的脱细胞程度;用处理后的大块脱细胞骨基质制作浸提液,行急性毒性实验、热源实验,观察大块异种脱细胞骨基质有没有毒性反应及热源性;用处理后的大块异种脱细胞骨基质材料与SD大鼠骨髓间充质干细胞体外复合培养,观察细胞生长、细胞增殖及蛋白质含量测定。结果:4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm骨块经过10%NaCl和0.5%曲拉通X-100联合处理72 h组及96 h组的异种脱细胞骨基质经HE染色及扫描电镜观察未见细胞成分,Masson染色观察胶原纤维基本结构未被破坏,材料浸提液急性毒性实验、热源实验符合规定标准,且骨髓间充质干细胞能够贴附在异种脱细胞骨基质孔隙内生长,细胞生长及蛋白合成功能不受异种脱细胞骨基质的影响。结论:大块异种脱细胞骨基质具有良好的生物相容性,可作为骨缺损修复的支架材料。

自体脂肪基质细胞组织-脱细胞骨基质-壳聚糖支架对兔胫骨骨缺损修复作用

目的:探究自体脂肪基质细胞组织(SVF)联合脱细胞骨基质-壳聚糖支架修复兔胫骨缺损的效果。方法:取新西兰兔背部皮下脂肪制备获取SVF细胞、取股骨干制备获取脱细胞骨基质,将SVF细胞种植于脱细胞骨基质-壳聚糖支架上,于种植当日及种植第7天时,扫描电镜观察支架上SVF细胞生长情况,计算种植当日及种植第3天时的SVF细胞存活率;将20只兔胫骨缺损动物模型均分为研究组和对照组,研究组用SVF-脱细胞骨基质-壳聚糖支架修复,对照组用脱细胞骨基质-壳聚糖支架修复;于术后6及12周时检测2组胫骨缺损部位的骨密度,并进行X线拍照,于术后12周时检测2组骨缺损部位最大弯曲度负荷、抗弯钢度及破坏扰度的力学特征,检测缺损骨骨膜中血管内皮细胞生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)水平。结果:电镜结果显示,SVF细胞种植第7天,支架上黏附大量的SVF细胞,并且SVF细胞在支架表面上生长、增殖;SVF种植当日的SVF细胞存活率为100.0%,种植第3天SVF细胞的存活率为(98.54±1.83)%,2者比较差异无统计学意义(P>0.05);术后第6及12周时,研究组新西兰兔骨缺损处的支架材料和周围骨组织之间的界限模糊,周围骨组织有骨茄形成;2组新西兰兔术后第12周时骨缺损部位骨密度均高于同组术后第6周,研究组术后同时点的骨缺损部位骨密度均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);术后第12周时,研究组新西兰兔最大弯曲度负荷和抗弯钢度大于对照组,破坏扰度低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);术后第12周时,研究组新西兰兔骨缺损部位骨膜中的VEGF和EGF蛋白水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:SVF-脱细胞骨基质-壳聚糖支架可促进兔胫骨骨缺损修复,可能机制与SVF促进骨膜内的血管新生有关。

基于脱细胞骨基质复合材料的制备方法及其理化性能研究

目的物理混合制备脱细胞骨基质(ACBM)与磷酸钙/硫酸钙(CPC/CS)复合材料,以提升人工骨材料的可塑性并观察其理化特性。方法选取健康牛股骨干骺端松质骨制备ACBM,以ACBM为主体填充磷酸钙/半水硫酸钙(CPC/CSH),制备复合人工骨支架。设置ACBM占复合材料总体质量的10%、20%和30%3组,分别测量各组力学性能(弹性模量和抗压强度),选取其中最优力学性能组,采用X射线衍射(XRD)分析仪、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、微量凯氏定氮法和液体置换法进一步分析其理化性能,并与同种异体骨和复合CPC/CSH进行力学性能比较。结果①ACBM不同占比复合材料中,20%ACBM复合人工骨材料具有最佳力学性能,能够承受最大应力923.81 N,最大变形4.92 mm,弹性模量(85.91±3.67)MPa,抗压强度(3.34±0.15)MPa,与其他两组相比差异具有统计学意义(P<0.001)。XRD显示,复合人工骨材料固化后主要是羟基磷灰石(HA)、CS和二水硫酸钙(CSD)等可吸收物质。扫描和透射电镜观察显示,材料孔径为(496.56±153.37)μm,内部孔隙相互贯通,连通性较好,缺损填充度高。材料蛋白质含量极低。液体置换法测量,孔隙率为(80.7±5.1)%。②力学性能测试,20%ACBM骨材料力学性能优于同种异体骨组和CPC/CSH组,差异有统计学意义(P<0.001)。结论20%ACBM复合人工骨材料具有较高的力学性能和孔隙率,可塑性强。

新型脱细胞骨基质材料的组织学结构及其细胞相容性观察

目的对新型脱细胞骨基质材料(acellular bone matrix,ACBM)的组织学结构及细胞相容性进行观察,探讨其作为组织工程骨支架的可行性。方法取健康18～24月龄雄性杂种犬股骨头负重区骨柱,高压水枪冲洗、脱脂,Trixon X-100、脱氧胆酸钠等进行脱细胞等理化处理,制备新型ACBM支架;对其行扫描电镜观察,HE染色、天狼星红染色及Hoechst 33258染色,评估其脱细胞程度及结构。采用密度梯度离心法分离培养犬BMSCs,取第3代BMSCs种植至ACBM支架上,MTT法分析支架浸提液毒性;复合培养3 d行倒置显微镜、扫描电镜、活/死细胞荧光染色、组织学等观察细胞在支架的生长、分化情况。结果 HE染色示ACBM支架去细胞彻底,无细胞碎片残留;天狼星红染色示支架呈深红及黄红相间染色;Hoechst 33258染色未见细胞残留。扫描电镜观察示ACBM支架内孔洞相互贯通,具有天然骨的孔径和孔隙率。MTT法检测示,培养1～6 d不同浓度(25%、50%、100%)支架浸提液与对照H-DMEM培养液吸光度(A)值比较差异均无统计学意义(P>0.05)。倒置显微镜、扫描电镜、组织学观察结果均显示细胞在支架上黏附良好,增殖显著,细胞基质分泌增加;活/死细胞染色示ACBM支架内细胞均呈绿色。结论 ACBM支架去细胞彻底,具备良好的孔径和孔隙率,无毒,细胞相容性良好,可作为良好的支架载体用于组织工程骨的构建。

新型脱细胞骨基质-壳聚糖复合支架的生物相容性研究

[目的]评价新型脱细胞骨基质-壳聚糖(ABECM/CS)骨组织工程复合多孔支架的生物相容性和安全性,为临床应用提供实验依据。[方法]采用联合脱细胞方法对猪股骨进行处理后制备脱细胞骨基质/壳聚糖骨组织工程复合支架。分离、培养兔骨髓间充质干细胞传代后进行实验。采用MTT法观察材料浸提液于1、3、5、7 d时进行细胞毒性实验观察细胞的活性;将材料浸提液与稀释血混合离心后观察红细胞溶血情况,检测OD值计算相对溶血率;将材料浸提液经静脉注入兔体内进行热原实验,在规定时间内观察兔体温变化。[结果]细胞毒性实验显示,培养1、3、5、7 d后各时间段内三组OD值两两比较(P﹥0.05)无显著差异,表明材料无毒性。在溶血实验中观察实验材料的溶血率为3.0%,在标准值溶血率5%范围内,提示无溶血现象发生。热原实验结果显示每只兔体温升高均低于0.6℃,且3只兔体温升高总度数低于1.4℃,符合热原检测规定,复合材料无致热作用。[结论]经联合脱细胞处理制备的ABECM/CS复合支架无细胞毒性、无溶血反应、无热原性,具有良好的生物相容性和安全性,可作为构建组织工程骨的支架载体材料。

去除移植免疫反应抗原成分脱细胞天然骨基质的制备

背景:同种异体骨来源广泛,便于大量加工贮存,如能去除其免疫排斥反应用于骨支架修复骨缺损,将很好地解决骨源问题,但目前去除免疫排斥的方法不尽理想。目的:运用低渗-脱细胞联合过氧化氢去除骨基质中引起免疫排斥反应的抗原成分。方法:将SD大鼠股骨经低渗-脱细胞、过氧化氢处理制备天然脱细胞基质,再通过苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色、扫描电镜与透射电镜观察、有机成分分析、洗脱剂残留量测定和移植免疫分析方法评估处理效果,并与新鲜大鼠股骨标本作比较。结果与结论:组织学观察可见处理后的脱细胞骨基质中胶原纤维排列规则,骨陷窝空虚,未见细胞,纤维连接蛋白和层粘连蛋白多存留在骨陷窝周边部。扫描电镜观察见处理后的骨基质板层连接疏松,板层之间出现大量孔隙;透射电镜见骨陷窝区已无高密度影;高效液相色谱仪检测TritonX-100在脱细胞骨基质中几无残留。光镜及扫描电镜均可见新鲜骨中有大量细胞成分。淋巴细胞刺激实验表明新鲜骨引起的免疫排斥反应明显强于脱细胞骨基质(P < 0.01)。说明联合应用低渗-脱细胞和过氧化氢处理基质的方法去除免疫排斥反应较为理想。

骨组织工程脱细胞骨基质的研究进展及存在问题

随着骨科学的发展,骨组织缺损治疗这一难题尤显突出,急需一种更为有效的疗法。骨组织工程是采用组织工程学的原理与方法,研制具有修复骨缺损能力的骨替代物的一门科学。经过20余年的发展,骨组织工程最终确立了将骨再生相关分子、成骨活性细胞与支架材料三者复合来构建组织工程骨的基本模式。支架材料是骨组织工程的核心,而作为支架材料之一的脱细胞骨基质(Acellular bone extracellular matrix,ABECM),近年来发展迅猛,展示出强大的生命力及临床应用前景。并且ABECM已有应用于临床试验的报道。本文将就此做一综述。

不同预处理脱细胞牛骨基质复合成骨化骨髓间充质干细胞生物相容性研究

目的将经成骨化诱导后大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)与脱细胞牛骨基质(ABECM)复合,构建组织工程骨。实验着重观察不同预处理方法对构建的组织工程骨的过程——细胞与ABECM复合和生长的影响,为有效快速构建组织工程化骨奠定理论基础。方法用Wistar大鼠2只,从股骨取MSC在体外扩增、纯化、诱导成骨化,做苏木精-伊红染色鉴定。实验组用胎牛血清(FBS)、多聚赖氨酸(PLL),对照组用磷酸盐缓冲溶液预处理的ABECM复合构建组织工程骨,体外培养。用流式细胞仪计数并计算细胞黏附率、测定碱性磷酸酶活性,倒置光学显微镜、扫描电子显微镜观察细胞生长、增殖情况。结果接种后6、12h实验组细胞黏附率高于对照组(P<0.05)。扫描电子显微镜观察:复合培养第3天,实验组细胞在材料表面已完全伸展,附着在材料表面;对照组细胞大多呈不规则形,未完全伸展。碱性磷酸酶活性测定:复合培养第3、6天,实验组的碱性磷酸酶活性均明显高于对照组(P<0.05)。结论用FBS和PLL分别预处理,可以改善ABECM材料表面特性,利于提高细胞接种效率,从而能更有效、更快速地构建组织工程骨。

脱细胞天然骨基质与诱导性成骨细胞的体外相容性

背景:前期工作表明TritonX-100处理的脱细胞骨基质已满足组织学和免疫学方面的修复要求。如果细胞能在材料表面很好地生长,将利于进一步进行体内动物实验。目的:采用细胞培养法在体外评估脱细胞骨基质与诱导后成骨细胞的生物相容性。方法:第3代骨髓基质干细胞经成骨诱导分化培养液诱导分化为成骨细胞,接种于TritonX-100处理的脱细胞骨基质及羟基磷灰石表面,检测成骨细胞的碱性磷酸酶表达并用扫描电镜观察材料表面的细胞生长情况。结果与结论:碱性磷酸酶活性分析均表明,TritonX-100处理的脱细胞骨基质在培养48h之后比羟基磷灰石更利于诱导成骨细胞生长;扫描电镜下可见,成骨细胞在脱细胞骨基质表面呈现立体生长方式,细胞呈球形,并且聚集成簇。体外实验结果显示成骨细胞与脱细胞天然骨基质有较好的生物相容性。