细菌脱色酶TpmD对三苯基甲烷类染料脱色的酶学特性研究

从嗜水气单胞菌DN322中分离纯化出能够对三苯基甲烷类染料结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿进行有效脱色的脱色酶，命名为TpmD。该酶的亚基分子量为29．4kDa，等电点为5．6。该酶催化上述4种三苯基甲烷类染料脱色反应的适合温度为40～60℃，适合pH范围为5．5～9．0。动力学参数测定结果显示TpmD对结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿的Km值分别为24．3、40．6、54．2、68．5μmol^-1·L^-1，Vmax值分别为19．6、74．1、82．8、115．6μmol^-1·L^-1。结晶紫为该酶的最适反应底物。TpmD催化的脱色反应依懒于NADH／NADPH及分子氧的存在，显示该酶属于NADH／NADPH依赖型的氧化酶类。这是国内外首次关于细菌中三苯基甲烷类染料脱色酶酶学性质的描述。

脱色酶和优势菌混合固定化降解染料的研究

本文对分离到的脱色优势菌ＮＤ１的脱色酶特性进行了研究，将脱色酶与苯胺降解菌混合固定化处理染料废水，结果表明，脱色酶在厌氧条件下对染料的脱色效果好，最适条件为３７℃，ｐＨ７．０；固定化酶相比粗酶液有更高的活性，对温度、ｐＨ、氧的要求范围较宽；混合固定化降解染料，脱色率及苯胺降解率分别大于８０％和９０％。

细菌脱色酶TpmD的酶学特性研究

从嗜水气单胞菌DN322中分离纯化出能够对三苯基甲烷类染料结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿进行高效脱色的脱色酶,命名为TpmD。在测定TpmD分子量、等电点及对不同三苯基甲烷染料脱色的动力学参数、脱色过程对分子氧及NADH/NADPH具有依赖性的基础上,又进一步从黄素FAD/FMN对酶活力的影响、酶抑制剂、酶蛋白N-末端测序及酶溶液的特征吸收光谱等方面对TpmD的酶学本质进行了分析。结果表明,TpmD不含核黄素,其脱色活性也不因加入FAD或FMN而提高。TpmD的N-末端氨基酸序列与多种氧化还原酶具有同源性。甲吡酮及维生素C(Vc)对TpmD的脱色活性具有明显的抑制作用。TpmD酶蛋白的溶液在408nm处有一特征吸收峰,但在连二亚硫酸钠的还原条件下通入CO气体后,该酶却不具有P450酶在450nm处的特征吸收峰。上述结果显示脱色酶TpmD是一种新的氧化酶。

染料脱色酶特性研究

从脱色优势菌ＮＤ１ 提取脱色酶，对酶特性进行研究．结果表明酶的最适作用条件为ｐＨ ７，３７℃，无氧环境，反应需ＮＡＤＨ 的参与；纯化结果表明经ＤＥＡＥ柱层析及Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ 凝胶层析后脱色速率分别提高１０ 倍和５０倍，Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００ 凝胶层析中２～４ 管蛋白具有偶氮和蒽醌染料脱色酶活性，６～１２ 管具有蒽醌染料脱色酶活性．

脱色酶TpmD在大肠杆菌中的高效表达及纯化

用PCR方法从嗜水气单胞菌DN322基因组中扩增出编码三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD的基因,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22-tpmD,转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组工程菌株.结果表明,经IPTG诱导,脱色酶基因可高效表达,粗酶液降解结晶紫、孔雀石绿、碱性品红、灿烂绿的比活力达到569.5,386.9,516.1,273.0U/g.表达产物经Ni-NTA亲和层析法一步纯化,蛋白纯度达94.05%.对4种染料的比活力分别达到1075.3,1042.8,903.9,484.3U/g,重组质粒稳定存在于工程菌中,便于规模化发酵生产.

壳聚糖固定化茶皂素脱色酶及其酶学性质的研究

以壳聚糖微球为载体,戊二醛为交联剂,对茶皂素脱色酶进行固定化,并对固定化酶的各种性质进行了研究。结果表明,0.5 g壳聚糖微球在5 mL 2.0%的戊二醛溶液中交联,固定5 mg茶皂素脱色酶,最终获得的酶活回收率为65.94%。固定化酶的最适温度为50℃,最适pH值为3.5,固定化酶的热稳定性、pH值稳定性以及保存稳定性都明显优于游离酶,该固定化酶还具有良好的操作性。

黄孢原毛平革菌茶皂素脱色酶的粗分离及酶学性质

对黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)TS-07发酵液中的茶皂素脱色酶进行粗分离,并对其酶学性质进行了研究。结果表明:用硫酸铵沉降法所得粗酶粉的酶活力高达52 971 U·g-1;该酶的最适反应温度为40℃,最适作用pH值为4.5;该酶在常温下具有良好的热稳定性,在pH值3.0～7.5环境下都比较稳定;Fe3+、Ca2+和Ni2+对酶活影响不大,Hg2+能强烈抑制茶皂素脱色酶的活性;10%(V/V)有机溶剂丙酮、异丙醇、乙醇和乙腈能保留茶皂素脱色酶大部分的活力;反应体系中H2O2达到5%,茶皂素脱色酶仍能保持较高的活力;而在反应底物不存在的情况下,茶皂素脱色酶与0.25%的H2O2保温1 h后,酶活残余量仍能达到80%以上。

磁场对紫色非硫光合细菌脱色酶的影响

本文采用在紫色非硫光合细菌(简称PSB)的培养液中加入钡铁氧体磁粉的方法研完了磁场对PSB脱色酶活力的影响。结果表明,磁场作用于PSB表现出有益的生物效应,可提高脱色酶活力,增加脱色速度。

秀珍菇染料脱色过氧化物酶基因的克隆及表达分析

通过对经低温刺激(10℃)和恒温(26℃)培养的秀珍菇菌丝体进行高通量转录组测序,利用生物信息学分析筛选获得秀珍菇染料脱色过氧化物酶全长基因(命名为PpDypA)。为了探究PpDypA在低温刺激后菌丝体中的功能与表达情况,克隆基因后进行生物信息学分析,结果表明该基因全长为1515 bp,编码504个氨基酸,其蛋白相对分子质量约54.8 kDa。氨基酸序列系统进化分析结果显示,染料脱色过氧化物酶家族具有很高的同源性,PpDypA编码蛋白与紫孢侧耳亲缘关系最近。经实时荧光定量PCR检测,该基因在秀珍菇经过低温处理后表达量显著上升,推测其可能经低温诱导表达,促使菌丝体启动抗氧化防御系统缓解低温逆境胁迫,且促进木质素降解从而为原基形成提供营养和能量。

无色杆菌属孔雀绿脱色菌产脱色酶的条件研究

已分离鉴定的无色杆菌属(Achromobacter sp.)菌株MGT3对孔雀绿染料具有强脱色作用,对其产酶脱色能力进行初步研究表明,该菌株不需要孔雀绿作为底物即可产脱色酶,即脱色酶的产生不需要底物的诱导;其胞内和胞外都存在脱色能力强的脱色酶.产胞外脱色酶的条件优化结果显示培养基的组成对该菌株产胞外酶的能力有很大影响.采用单因素结合正交试验优化产酶培养基结果表明,培养基的最佳组成成分为0.5%蔗糖、2.5%尿素、0.0025%KH_2PO_4;该菌株在培养基初始pH为9、温度为35℃时产脱色酶效率高,对孔雀绿脱色率高.

Pycnoporus sp.SYBC-L3漆酶催化偶氮染料脱色

为考察Pycnoporus sp.SYBC-L3漆酶Lac-L对偶氮染料的脱色、解毒效果,探究最佳的脱色反应条件,采用单因素分析方法研究了不同的反应条件对Lac-L催化3种偶氮染料(AR1、RB5、RV5R)脱色的影响,得到最佳处理条件,并通过比较被漆酶降解前后的染料对小麦和水稻发芽率及根、芽生长的影响,分析其毒性变化。结果表明:在以HBT为介体、反应温度50℃、pH分别为4.0(AR1,RV5R)和5.0(RB5)、漆酶用量1 U/mL、染料初始质量浓度分别为30 mg/L(AR1)和50 mg/L(RB5、RV5R)条件下,漆酶对3种偶氮染料的脱色效率最高,AR1和RV5R几乎完全降解,脱色率达到96.1%和97.8%,而RB5也有83.8%的脱色率。植物毒理实验表明,3种偶氮染料经漆酶降解后对小麦和水稻发芽率没有影响,对胚芽和根生长的抑制作用也有所降低。

共表达谷氨酰-tRNA还原酶增强染料脱色过氧化物酶在大肠杆菌中的表达活性

染料脱色过氧化物酶(dye-decoloorizing peroxidase,DyP)属于以血红素为辅基的新型过氧化物酶类,常因缺乏辅因子而导致催化活性低。将来源于褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的染料脱色过氧化物酶基因(TfuDyP)与大肠杆菌谷氨酰-tRNA还原酶基因(hemA),构建重组质粒phemA-DyP,转化至E.coli BL21中进行共表达。分别以2,2-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和顽固性染料活性蓝19(RB19)、溴酚蓝、溴甲酚绿为底物检测TfuDyP的催化活力以及染料脱色效率。结果表明,诱导后的共表达菌株pAD胞内血红素含量为9. 8μmol/L,而单独过表达基因TfuDyP的菌株pD仅为3. 4μmol/L。TfuDyP纯酶的全波长扫描分析表明,在菌株pAD中DyP酶与血红素的结合度相比pD有较大幅度的提升。pAD菌株表达的DyP酶活力较pD菌株提高了110%,酶活力的提高使其在染料脱色应用方面也得到增强。在pAD菌株培养基中分别添加谷氨酸(Glu)、FeCl2使得胞内血红素含量、DyP酶活力和染料脱色效率比未添加时进一步提高。以上结果为TfuDyP的功能开发奠定了基础,同时也为其他血红素依赖性过氧化物酶的研发提供借鉴。

褐色嗜热裂孢菌脱色过氧化物酶的表达及发酵条件优化

为了提高来源于褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脱色过氧化物酶(TfuDyP)对蒽醌染料降解能力,将含有目的基因的重组质粒pET-28a(+)-TfuDyP,转化至E.coli BL21进行异源表达,并对重组TfuDyP的发酵条件进行优化,分析酶活与血红素饱和度之间的关系。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测到分子质量为46 kDa的重组TfuDyP蛋白条带。TfuDyP的最佳诱导条件为:诱导剂(IPTG)浓度0.3 mmol/L,诱导时间14 h,诱导温度30℃,在此条件下,TfuDyP比酶活达到27.9 U/g。氯高铁血红素、5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)、谷氨酸(Glu)、FeCl2、MnCl2均可提高重组TfuDyP的催化活性,酶活的提高与血红素饱和度之间存在一定的正相关性。实验结果可为利用外源添加物提高血红素的饱和度,应用于染料脱色过氧化物酶的工业发酵提供理论依据。

人工脱色过氧化物酶催化降解苋菜红活性研究

以肌红蛋白(Mb)为骨架构建并纯化了三突变体蛋白F43Y/F138W/P88W Mb,双突变体蛋白F43Y/F138W Mb及单突变体蛋白F43Y Mb,并对三个突变体蛋白的苋菜红(amaranth)脱色降解活性进行了研究。催化活性及酶动力学研究结果显示,相比于F43Y/F138W Mb和F43Y Mb,三突变体F43Y/F138W/P88W Mb的苋菜红催化效率最高,这表明色氨酸对人工脱色过氧化物酶的活性起了重要作用。该研究不仅为今后的血红素蛋白设计提供了理论依据,同时也表明人工酶在染料废水处理方面具有潜在的应用价值。

红球菌染料脱色过氧化物酶的异源表达及活性分析

染料脱色过氧化物酶(dye-decolorizing peroxidase,DyP)属于以血红素为辅基的新型过氧化物酶超家族。由于能够降解蒽醌类染料,DyP成为当今绿色经济的研究热点,而染料的有效降解与酶活性密切相关,因此寻求提高酶活性的方法是DyP后续生产应用的关键所在。克隆来自红球菌(Rhodococcus jostii)的染料脱色过氧化物酶基因RhDypB,实现在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的高效表达,并对提高酶活性的方法进行了研究。利用一步克隆技术构建重组菌株pET24b-DypB/BL21,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导使蛋白表达,镍柱亲和层析纯化蛋白,比较了外源添加血红素合成前体5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)和共表达大肠杆菌血红素合成途径中的谷氨酰-tRNA还原酶基因(hemA)对酶活性的影响。SDS-PAGE显示在40 kDa有明显的目的条带(纯度达到90%),蛋白质量浓度可达100 mg/L。添加5-ALA以及共表达hemA分别使血红素浓度增加至8.9和2.4μmol/L,相应的酶活性提高了102%和93%。RhDypB的可溶性表达与血红素含量的提升,为以血红素作为辅因子的过氧化物酶的相关研究提供依据。

无花果曲霉对直接冻黄(G)的脱色特性研究

文章利用无花果曲霉对直接冻黄G进行脱色研究 ,在搅拌条件下 ,菌丝球能有效地使直接冻黄G脱色(>90 %在 2 4h内 )。在限氮培养基中 ,对影响脱色过程的因素进行了试验 ,这些因素包括 :葡萄糖浓度、酒石酸铵浓度、原初pH及温度。结果表明 :该菌丝球对染料脱色的最佳温度为 30℃ ,最佳pH 5 .0 ,培养基成分对脱色也有一定的影响。该菌对染料的脱色酶为组成酶 ,脱色酶在细胞内、外均有分布 ,染料对酶无诱导作用。

皮革染料的生物降解研究进展

以皮革染色中用量最大的3种染料—偶氮染料、蒽醌染料、三苯基甲烷染料为研究对象,重点阐述了好氧和厌氧条件下3种染料的生物脱色机理,综述了各种染料脱色酶的国内外研究进展,提出了皮革染料共基质生物降解的研究方向。

灵芝漆酶对直接蓝86的催化脱色性能

利用灵芝菌Ganoderma lucidum U-281漆酶对直接蓝86进行酶促氧化脱色,并对其降解机理进行了探讨。结果表明,染料-漆酶共反应体系在20～50℃及pH小于5.0范围内,直接蓝86均可脱色50%以上;漆酶对直接蓝86具有宽泛的浓度适应性,对300 mg/L的该染料仍具有耐受性。最优脱色工艺参数为温度40℃、pH 5.0、染料初始浓度200 mg/L、漆酶用量1 U/mL。在优化条件下,直接蓝863 h的脱色率达到54.54%,48 h脱色率达到91.54%。紫外-可见吸收光谱分析表明,漆酶的酶促氧化导致染料的分子结构产生了变化,是造成直接蓝86脱色的主要发生机制。

灵芝漆酶催化阳离子红2GL脱色的研究

真菌漆酶在纺织物染料脱色及其废水净化等领域有着巨大的应用潜力。阳离子红2GL是使用广泛又难以处理的一种染料,现有的方法治理效果差。本研究优化了灵芝漆酶催化阳离子红2GL脱色的主要工艺参数:最适pH、温度、ABTS用量、漆酶用量和染料浓度分别为4.5、20℃、0.083mmol/L、10U/mL和50mg/L。在所得的最优条件下反应30min,阳离子红2GL的脱色率可达90.3%;反应24h,脱色率达100.0%。

灵芝漆酶催化直接耐晒翠蓝GL脱色条件的优化

采用灵芝菌株发酵所得的漆酶,对酞菁类染料直接耐晒翠蓝GL进行了催化脱色实验,确定了脱色反应的最适条件。结果表明:单独使用灵芝漆酶粗酶液对直接耐晒翠蓝GL具有很好的脱色效果。其最适脱色pH为3.0,最适脱色温度为40°C,最适漆酶用量是40U/mL,最适染料浓度为60mg/L。以上述最适脱色条件对直接耐晒翠蓝GL进行脱色实验,反应70min,脱色率可达94.3%。研究结果显示,所试灵芝漆酶在印染废水治理方面具有良好的应用前景。