茶树脱落酸β-葡萄糖基转移酶基因CsAOG的克隆和表达分析

脱落酸(ABA)β-葡萄糖基转移酶(abscisate beta-glucosyltransferase)是ABA分解代谢途径中的关键酶,在维持植物体内ABA正常生理水平上发挥着重要作用。通过RACE法克隆了茶树中ABAβ-葡萄糖基转移酶基因CsAOG,NCBI登录号为MF370238。CsAOG全长为2 108 bp,ORF大小为1 443 bp,无内含子,该基因编码480个氨基酸,分子量约为53.26 kDa,等电点为5.58,亚细胞定位于细胞质。CsAOG蛋白具有葡萄糖基转移酶(UDPGT)保守结构域。通过MEME分析工具在CsAOG序列中获得了9个保守元件。由系统进化和蛋白互作分析可知,CsAOG位于UGT73分支,且UGT73B4与UGT73B5的互作最强。实时荧光定量结果表明,叶中CsAOG表达水平最高,根部次之,茎中最低;在越冬期间,乌牛早CsAOG表达量先上调后下调,最后维持在较低水平;舒茶早和黄山早芽CsAOG表达量呈下调趋势。赤霉素处理后,乌牛早CsAOG表达量上调;高温胁迫后CsAOG表达量呈先升后降的趋势,12 h时表达量最高,而低温胁迫时表达量变化不大。通过对CsAOG基因的研究,为理解ABA在调控茶树生长发育和抗逆机制中的作用提供了理论基础。

Bacillus globisporus N75 6-α-葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达

6-α-葡萄糖基转移酶具有催化α-1,4-葡聚糖的外切水解和转糖基化功能,可通过转糖基活性产生非还原端连有α-1,6键的α-葡聚糖,可用于生产环交替糖及其分支衍生物和环异麦芽寡糖等新型功能糖。为了更好地将6-α-葡萄糖基转移酶应用于食品领域,该研究对来源于Bacillus globisporus N75的6-α-葡萄糖基转移酶在食品安全级菌株枯草芽孢杆菌中进行重组表达,并通过表达宿主的选择及优化发酵条件进一步提高重组蛋白产量。结果表明,宿主WHS9更有利于6-α-葡萄糖基转移酶的重组表达,在20℃的发酵条件下,胞内外可溶性总酶活力可达2.11 U/mL;在25℃添加20 mmol/L海藻糖发酵48 h后,总酶活力可达到2.21 U/mL;优化发酵时间后,发酵36 h总酶活力可达3.14 U/mL,是优化前WHS9表达酶活力的196倍。该研究首次实现了6-α-葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的重组表达。

甘油三酯-葡萄糖指数与γ-谷氨酰基转移酶在中青年代谢综合征诊断中的临床应用

目的探讨甘油三酯-葡萄糖(TyG)指数与γ-谷氨酰基转移酶(GGT)预测中青年代谢综合征(MS)的临床价值。方法选取2022年12月至2023年9月在首都医科大学附属北京世纪坛医院肥胖与代谢中心住院治疗的151例中青年MS患者作为研究对象(MS组),另选取同期在医院进行健康体检者130例作为对照组,分别测定两组的代谢及炎症指标。MS组根据MS组分数目分为MS3组(101例)、MS4组(32例)及MS5组(18例),比较三组TyG指数、GGT水平。采用Pearson相关检验分析TyG指数、GGT与MS诊断指标的相关性。通过多因素logistic回归分析MS发生的危险因素。使用受试者操作特征(ROC)曲线评估TyG指数、GGT预测MS的价值。结果MS组患者TyG指数、GGT显著高于对照组,MS5组TyG指数、GGT显著高于MS3组和MS4组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析显示,TyG指数、GGT水平与体重指数、舒张压、收缩压、空腹血糖、甘油三酯呈正相关(P<0.05),与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关(P<0.05)。Logistic回归分析显示,TyG指数、GGT均为MS的危险因素。ROC曲线分析显示,TyG指数、GGT预测MS的曲线下面积(AUC)分别为0.72(95%CI 0.66~0.781)、0.675(95%CI 0.612~0.739)结论中青年MS患者TyG指数、GGT表达明显增高,二者均与MS的发生密切相关。

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT)基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b(+)中,构建了表达载体pET-20b(+)/cgt,并将其转化表达宿主E.coliBL21(DE3)。对重组菌E.coliBL21/pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件:葡萄糖8 g/L,乳糖0.5 g/L,蛋白胨12 g/L,酵母膏24 g/L,K2HPO472 mmol/L,KH2PO417 mmol/L,CaC l22.5 mmol/L;初始pH为7.0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90 h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22.1 U/mL,与来源菌P.macerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3 L发酵罐中发酵,90 h后胞外酶比活达到22.6 U/mL,证实了工业化放大的可能性。

嗜热芽胞杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽胞杆菌中的表达

【目的】构建分泌表达α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)的重组枯草芽胞杆菌,实现α-CGTase的安全高效表达。【方法】通过PCR法扩增嗜热地芽胞杆菌α-CGTase基因,运用EcoRI/XhoI分别对α-CGTase基因及pBES进行双酶切,然后将该基因片段插入到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭载体pBES中,再电转化法转化枯草芽胞杆菌RIK1285;对重组枯草芽胞杆菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT发酵条件进行探索。【结果】(1)利用发酵培养基分泌表达α-CGTase,重组枯草芽胞杆菌工程菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT发酵上清液产酶达到2.9U·mL-1。(2)TB为最适发酵培养基(配方:甘油0.5%,蛋白胨1.2%,酵母粉2.4%,K2HPO41.64%,KH2PO40.23%);在初始pH6.5,温度为37℃下,摇瓶发酵培养24h后,α-环糊精酶的环化活性达到5.3U·mL-1,是野生菌株嗜热地芽胞杆菌(0.66U·mL-1)的8倍。【结论】成功构建了枯草芽胞杆菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT工程菌,并确定其最适发酵培养基和培养条件。

β-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株02-5-71的选育及发酵条件研究

应用氮离子注入对嗜碱芽孢杆菌进行诱变育种,获得了产生β-环糊精葡萄糖基转移酶是出发菌株2倍以上的高产菌株,酶活力可达6000U/mL以上.应用正交实验法筛选出最优发酵条件.

γ-环状糊精葡萄糖基转移酶产生菌32-3-10产酶条件及酶促反应条件的研究

筛选到一株芽胞杆菌 32 - 3- 10 ,它所产γ -环状糊精葡萄糖基转移酶可以淀粉为底物生成γ -环状糊精 ,对其产酶条件及酶促反应条件进行了研究。

重组β-环糊精葡萄糖基转移酶生产β-环糊精的工艺条件优化

将来自于Bacillus circulans 251的β-CGTase编码基因克隆到表达载体pET-20b(+),转化Escherichia coli BL21(DE3)。经酶活检测培养基上清中的β-CGTase酶活为20 U/mL。对酶转化淀粉生成β-环糊精的反应条件进行了优化,结果表明,当底物马铃薯淀粉浓度15%,反应初始pH5.5,温度30℃,加酶量10 U/g干淀粉,环己烷浓度2.5%-5%(V/V),转化周期24 h,β-环糊精转化率达到最高值75.3%,是国内外报道的酶法生产β-环糊精的最高水平。

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯化及性质研究

报道了一种主要转化产物是α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性。将发酵上清液通过硫酸铵分级沉淀、疏水柱层析和离子交换层析获得表观电泳纯的酶蛋白。纯酶的分子量约为75kDa,等电点5.3。最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。对可溶性淀粉的Km和Vmax值分别是50mg/ml和6.07mg/ml/min。色氨酸残基为酶活力的必需基团。酶的N末端序列为-SPDTSVDNKV-。Ca2+,Zn2+,Fe3+,Cu2+,Fe2+,Ag+对酶活力有强烈抑制作用。纯酶催化转化条件试验表明,廉价的马铃薯淀粉是酶催化制备α-CD的适宜底物,最佳转化条件为:酶量200μ/g淀粉,温度40℃,反应时间24h,总转化率达41%,其中α-环糊精占总转化产物的78%。因此,该酶不仅表现出特殊的酶学特性,而且有较好的产业化开发前景。

β-环状糊精葡萄糖基转移酶发酵染菌的分离和16srDNA分析

目的:解决β-环状糊精葡萄糖基转移酶发酵生产过程中频繁出现的不明原因的酶活降低问题。方法:我们采用特异性酚酞筛选培养基对发酵异常的发酵液进行菌种分离,对分离得到的菌株进行16 srDNA基因序列分析,同时研究他们的发酵过程中光密度、酸碱度、酶活指标。结果:分离得到了一株可以在碱性条件下与正常生产菌共生的芽孢杆菌。经过对发酵过程进行研究,在不同的发酵时期中该菌的光密度的变化和正常生产菌有明显差异,最终酶活仅为正常菌的1/6。通过对16 srDNA基因序列进行分析,确定其为芽孢杆菌,和正常生产菌基因相似度达到93.81%。结论:在生产中采用16 srDNA基因序列分析,可以排除染杂的的生产菌种。只要严格控制发酵出发菌株和严格保证发酵环境的纯培养条件,可以防止染菌的发生。

响应面法优化多黏芽孢杆菌产α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵培养基

为了提高多黏芽孢杆菌YLW-8产α-环糊精葡萄糖基转移酶的能力,对培养基条件进行优化,并利用优化后的培养基条件考察培养时间及不同初始p H对YLW-8产酶的影响。采用Plackett-Burman重要因素筛选实验筛选出影响产酶的3个主要因素:玉米淀粉、麸皮、磷酸氢二钾。在此基础上利用最陡爬坡实验逼近最大响应值区域,最后利用中心组合实验确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。结果表明,玉米淀粉1%,硫酸铵0.15%,麸皮1.5%,碳酸钙0.5%,蛋白胨0.5%,磷酸氢二钾0.01%,酵母膏0.4%,硫酸镁0.015%时,α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活为3089.8U/m L,利用该培养基条件培养时间可缩短至3d,初始p H8.0。该条件可以降低染菌的几率,大大减少生产成本,可应用于α-环糊精生产工业。

发酵生产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的气球菌(Aerococcus sp·P3-2)污染及防治

我们从环状糊精生产厂家的β-环状糊精葡萄糖基转移酶发酵失败的发酵液中分离出一株气球菌。此菌可以在发酵专用碱性培养基上生长,但不生产β-环状糊精葡萄糖基转移酶。通过研究该菌种在碱性培养基上的发酵过程中的pH、OD、酶活,同时使用16SrDNA进行分析,证明此菌种为气球菌(Aerococcussp.P3-2),其在发酵过程中可以明显降低发酵培养基的pH,对正常生产菌形成抑制。通过对发酵生产可能染菌的环节进行微生物取样分析,该菌种大量存在于空气过滤系统的积水中,从而找到污染源,由此判断是由于空气净化系统被污染所导致的发酵失败。在实际生产中定期对空气净化系统中的积水进行排放处理,同时对发酵过程中的酶活和pH进行监控,可以做到发酵污染的早发现直至杜绝发酵污染。

N^+注入诱变选育β-环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株及其发酵条件优化

以一株产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的蜡状芽孢杆菌BC-0801为出发菌株,利用10keV,剂量为40×2.5×1013ions/cm2氮离子进行诱变选育,获得一株高产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的突变体BC-0802。对该突变体BC-0802发酵培养基的碳源、氮源及无机离子进行单因素试验分析,采用3个因素正交试验确定其最佳发酵培养基成分质量浓度及发酵条件为:玉米粉30g/L、酵母浸膏15g/L、K2HPO41g/L,发酵温度30℃、pH 9.0、接种量2%、发酵周期36h。结果表明;突变体的平均酶活力可达3415.8U/mL,相较于出发菌株酶活力提高了3.67倍,且该突变体的遗传稳定性较好。

重组α-环糊精葡萄糖基转移酶表达条件的优化及其产物专一性的分析

将来源于Bacillus sp 602-1的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT)基因(cgt)插入到表达载体PQE30中,构建重组质粒PQE30/cgt,成功转化宿主菌E.coli M15后,得到重组菌株E.coli M15(PQE30/cgt)。在IPTG的诱导下得到酶表达的最适条件:TB培养基,0.01 mmol/L IPTG,诱导温度16℃,胞内酶比活力最高可达5 209 U/mL;加入IPTG 24 h后,添加甘氨酸和甘露醇会促使酶向胞外分泌。酶蛋白自诱导表达的适宜条件为在TB培养基中添加乳糖3.0 g/L,葡萄糖1.2 g/L,16℃培养96 h,酶比活力达到8 635 U/mL,明显高于IPTG诱导的效果。通过SDS-PAGE验证了上述结论。酶催化转化实验表明:重组酶转化质量分数为1%可溶淀粉24 h后,α-环糊精(α-CD)转化率可达38.2%,α和β的峰面积比约为3.4∶1,α-CD具有较高的专一性,因此该重组α-CGT酶具有较好的工业化应用前景。

应用02-5-71菌株葡萄糖基转移酶制备β-环糊精的研究

对环糊精葡萄糖基转移酶催化淀粉生成β 环糊精(β CD)的转化条件进行了研究.结果表明,转化最适pH为6.5～8.5;随底物浓度增加β CD生成量增多而转化率降低;酶用量在1000U.g-1淀粉较合适;5%甲苯及2%乙醇能显著提高β CD的转化率,以14%马铃薯淀粉为底物转化60h转化率较对照分别提高57.18%及28.36%;5%马铃薯淀粉加入10%乙醇转化24hr转化率可达57.97%.

产β-环糊精葡萄糖基转移酶高温菌株HY15发酵条件优化

以一株产β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)的嗜热菌株HY15为研究对象,采用单因素试验研究碳源、氮源、初始pH值、培养温度、MgSO4·7H2O等对酶活力影响。并设计正交试验优化其发酵条件。结果表明最优的发酵条件为:碳源为玉米淀粉+糖蜜,氮源为玉米浆,初始pH7.0,培养温度60℃、摇床转速220r/min,MgSO4浓度10mmol/L,在此条件下,β-CGTase酶活力可达1794.3U/mL。

多黏芽孢杆菌产ɑ-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达及其转化产物特异性研究

通过设计简并引物,从Paenibacillus macerans YLW菌株中克隆到其α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)基因,构建重组质粒α-CGTase-p ET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),得到重组菌株α-CGTase-p ET28a/BL21(DE3)。在16℃,1m M IPTG条件下诱导15 h,实现了α-CGTase的可溶性表达,胞内酶活达到10046U/m L,是野生菌株胞外酶活的3.25倍。经镍柱一步法亲和纯化α-CGTase后,酶蛋白纯化了6.05倍,酶收率28.82%,通过SDS-PAGE检测获得表观电泳纯酶蛋白。酶催化转化实验表明:重组α-CGTase酶转化质量分数为5%的马铃薯淀粉15 h后,环糊精的总转化率可达40.7%,转化生成α-CD,β-CD,γ-CD比例分别为:43.6%、41.8%和14.6%。该重组酶对α-CD具有较好的转化专一性,通过转化条件的进一步优化将具有非常好的产业化开发前景。

家蚕尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶基因(BmUGT004965)的克隆和表达谱分析

糖基化作用在抑制和排除生物体一系列内生和外生有毒化合物的过程中非常重要,尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶(UGTs)参与了这一过程。在分析家蚕基因组中存在的UGT基因时选取其中的一个基因进行生物信息学分析与分子生物学实验,经分子克隆和表达谱分析,将该基因命名为BmUGT004965,其开放读码框(ORF)长1 578 bp,编码525个氨基酸,预测分子质量60.3 kD,等电点9.13。该基因编码蛋白的N端具有一段由19个氨基酸组成的信号肽序列,而且N端和C端各有一段疏水的跨膜区。将该基因cDNA与家蚕基因组序列进行比对表明其具有4个外显子,外显子/内含子边界处均符合GT-AG规则。将家蚕BmUGT004965基因与人类、果蝇、昆虫杆状病毒、植物及已报道的家蚕UGT基因进行氨基酸水平的比对,显示氨基酸序列一致性为20%～30%;多重序列比对结果表明C端序列的保守性高于N端区域,可能与UGT具有2个主要的功能域有关。实时定量RT-PCR检测表明,在5龄第3天家蚕幼虫的9种组织中,BmUGT004965基因只在丝腺和脂肪体中有表达,且丝腺中的表达丰度明显高于脂肪体,这与基因芯片的结果一致,推测这种特异的表达方式可能与其特异的功能有关。

β-环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株LZ10发酵条件的优化

环状糊精葡萄糖基转移酶是催化淀粉水解为环状糊精的酶。以β-环状糊精葡萄糖基转移酶高产菌株LZ10为研究对象,分别对该菌发酵培养基的碳源、氮源和pH进行了单因子分析,并对该3个因素进行正交实验及验证,最终确定该菌的最佳发酵培养基配方:玉米粉2.5%,黄豆粉5%,NaCO30.2%,K2HPO4.3H2O0.13%,MgSO4.7H2O0.02%,pH为9.0。在该条件下,菌株LZ10产β-环状糊精葡萄糖基转移酶的酶活可达892.86u/mL酶液。

基于响应面法优化HY15发酵生产β-环糊精葡萄糖基转移酶的发酵条件

为了提高β-环糊精葡萄糖基转移酶产酶活力,应用Plackett-Burman设计法对影响高温菌株HY15发酵的10个因素进行了筛选,确定了主要影响因素,然后通过响应面法优化了各因素的最优质量浓度,建立了β-环糊精葡萄糖基转移酶产率的二次多项式数学模型,并分析了模型的有效性与因子间的交互作用。结果表明:影响β-环糊精葡萄糖基转移酶产率的主要因素及其最优质量浓度为:糖蜜+玉米淀粉22.45 g/L,K2HPO40.97 g/L,MgSO40.18 g/L,玉米浆+酵母21.82 g/L,pH值6.98。在优化后的培养基条件下,β-环糊精葡萄糖基转移酶酶活力达到1 409.70 U/mL,验证值1401.81 U/mL,二者吻合较好。