CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sg RNA(Small guide RNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。目前,已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sg RNA设计和/或脱靶效应评估软件,但不同的软件各有优缺点。本文重点对16款sg RNA设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述,通过制定38项评估指标对不同软件进行了比较分析,最后对11种用于检测基因组编辑效率和脱靶的实验方法,以及如何筛选高效且特异的sg RNA进行了归纳总结。

CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失、插入、修复等。CRISPR/Cas9比锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(Single guide RNA,sg RNA)是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别。研究发现,设计的sg RNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。为了避免脱靶效应,研究者对影响脱靶效应的因素进行了系统研究并提出了许多降低脱靶效应的方法。文章总结了CRISPR/Cas9系统的应用及脱靶效应研究进展,以期为相关领域的工作提供参考。

基于CRISPR/Cas9系统的OsbHLH116基因编辑及其脱靶效应分析

以水稻OsbHLH116基因为编辑对象,根据基因编码区序列(CDS)在第一外显子区域设计长度为19bp的sgRNA,化学合成sgRNA的寡核苷酸序列,然后与CRISPR/Cas9系统表达载体pBUN411连接,再用农杆菌介导法获得水稻转基因株系,最后利用酶切和测序相结合的方法对OsbHLH116突变体进行了筛选鉴定和脱靶效应分析。结果表明,所构建的pBUN411-gRNA载体成功实现了对基因OsbHLH116的定向编辑。酶切分析表明在选取的10株T0代转基因苗中得到了6个OsbHLH116突变单株。对6个突变单株进行了TA克隆测序分析,发现了纯合突变、双等位突变和杂合突变3种类型。酶切分析表明2个潜在脱靶位点均未发生脱靶效应。

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列,并构建Cas9-MAD2L1载体,将该载体转染到NIH/3T3细胞中,通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后,提取细胞转染后的基因组DNA,利用PCR方法,结合T7E1分析和桑格尔测序,鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况,并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞,PCR结合T7E1结果显示,以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物,可被酶切成166 bp和62 bp片段,测序结果显示,成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑,脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系,设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。

CRISPR/Cas9系统中的脱靶效应及检测技术研究进展

聚类规则间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及其相关蛋白(Cas9蛋白)已经成为精确编辑基因组的强大工具。CRISPR/Cas9系统源自于细菌和古生菌的免疫机制,结构简单、易于设计,仅需改变单引导RNA(single-guide RNA,sgRNA)上的一小段序列即可快速实现对不同基因位点的编辑。与锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)技术相比,CRISPR/Cas9系统基因编辑效率更高、特异性更强。但在应用过程中不可避免的脱靶事件严重限制了CRISPR/Cas9系统的进一步发展,因此本篇文章就CRISPR/Cas9系统的脱靶类型、影响因素、降低策略以及脱靶检测技术进行综述。

CAR-T细胞治疗肿瘤的脱靶效应及其预防策略

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)是单链抗体的可变区(single-chain variable fragments,scFv)和T细胞信号分子的重组融合蛋白,它使T细胞可以通过非MHC限制性方式识别特异性抗原。最近的临床研究证明,CAR-T细胞在治疗B细胞肿瘤中取得了显著效果。但在目前的临床应用中存在诸多限制,尤其是当肿瘤抗原在正常组织中表达时会造成脱靶效应。本文就靶抗原的选择、脱靶效应及相应的预防策略作一综述,期望这些策略的实施,将会提高CAR-T细胞治疗的安全性及有效性,使更多肿瘤患者从中获益。

靶向HER2和CLDN18.2的并联嵌合抗原受体T细胞降低对胃癌的脱靶效应

目的探讨靶向闭合蛋白18亚型2(CLDN18.2)和人类表皮生长因子受体2(HER2)的双受体嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞是否可以降低脱靶效应,并发挥抑制胃癌细胞生长的作用。方法Western blot和流式细胞术检测肿瘤细胞中CLDN18.2和HER2的表达情况;慢病毒感染法构建过表达CLDN18.2和HER2的肿瘤细胞系;慢病毒感染法构建CAR-T细胞;流式细胞术检测CAR-T细胞的阳性率和亚型分布;乳酸脱氢酶(LDH)法检测CAR-T细胞对靶细胞的细胞毒性;裸鼠移植瘤模型检测CAR-T细胞的体内抑瘤效率;免疫组化法检测肿瘤组织中CD3^(+)T细胞的浸润情况。结果成功筛选得到高表达或不表达CLDN18.2和HER2的胃癌细胞系,并构建得到CLDN18.2和HER2单独表达或同时表达的胃癌细胞系;成功构建CAR-T细胞Cz、Hbb和CHbbz;Cz和CHbbz在体外对CLDN18.2^(+)和CLDN18.2^(+)HER2^(+)的肿瘤细胞系均具有特异性的剂量依赖的细胞毒性(P<0.001);在裸鼠移植瘤模型中,只有CHbbz可以对CH-AGS的肿瘤细胞产生体内抑瘤活性及T细胞的肿瘤浸润(P<0.01),同时CHbbz只对CLDN18.2^(+)HER2^(+)的肿瘤细胞产生抑瘤活性及T细胞的肿瘤浸润(P<0.01)。结论靶向CLDN18.2和HER2的双受体CAR-T细胞可以降低脱靶毒性发生的概率,并抑制胃癌的生长,是一种胃癌治疗的潜在方法。

siRNA脱靶效应研究进展

RNA干扰过程中,siRNA和mRNA特异结合能够使得靶基因沉默。但研究证实,siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默,这种现象称为siRNA脱靶效应。多种真核生物中的RNA干扰实验证实了脱靶效应的存在。对脱靶机制的研究发现脱靶可能与模体匹配、结构和长dsRNA等有关,很多新方法被提出来预测脱靶概率和检测脱靶基因。通过利用siRNApool、化学修饰和生物信息学方法能够尽可能地降低脱靶效应,提高RNAi实验的质量。对脱靶效应方面的研究进行了总结论述。

CRISPR/Cas9技术的脱靶效应及优化策略

近年,CRISPR/Cas9系统已经迅速成为医学领域最具潜力的基因编辑工具,它是继锌指核酸内切酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs)之后的第三代人工改造的核酸内切酶,被喻为"基因魔剪".该基因编辑系统最大优势在于只需要设计一个靶向目标序列的sgRNA(single-guide RNA)就能引导Cas9核酸酶结合到特定的基因序列,并指导Cas9核酸酶切割相应的结合位点,进而完成对靶基因的编辑.由于其设计简单、实施快捷、成本低廉,突变效率高等优点,这一系统在基因组功能鉴定、抗病毒、抗肿瘤、免疫治疗等众多领域已广泛研究.虽然CRISPR/Cas9系统具有如此多的优点,但是其可能存在的脱靶风险影响了该基因编辑技术的深入研究,增加了用于疾病治疗的风险,阻碍了临床的进一步应用.如何保证CRISPR/Cas9基因编辑技术高编辑效率,同时也能降低脱靶效应,这将是未来科学研究者深入研究CRISPR/Cas9技术并开拓其临床应用亟待解决的问题.为此我们在文章中对CRISPR/Cas9系统组成、作用机制及应用进展进行简要综述,着重介绍目前这一领域广受关注的脱靶效应,并归纳优化策略,以期为更多的研究者提供参考.

发动蛋白(dynamin)抑制剂Dyngo-4a在大鼠骨髓间充质干细胞内吞葡聚糖过程中存在脱靶效应

目的研究发动蛋白(DNM)抑制剂Dyngo-4a在依赖DNM的内吞途径中可能存在的脱靶作用。方法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)并进行流式细胞术鉴定,将细胞分为抑制剂对照组、Dyngo-4a处理组、转染阴性对照(si-NC)组、DNM2小干扰RNA(si-DNM2)转染组、转染和Dyngo-4a共处理组。反转录PCR和Western blot法验证DNM2基因沉默效率,CCK-8法检测Dyngo-4a处理后细胞活性变化,共聚焦显微镜检测内吞的Dylight649标记的转铁蛋白(transferrin-Dylight649)和四甲基罗丹明标记的葡聚糖(dextran-TMR)阳性的囊泡数量以及平均荧光强度。结果使用小干扰RNA能显著下调BMSC的DNM2的mRNA和蛋白表达,转染组内吞的转铁蛋白囊泡数量与转染阴性对照组比较明显降低,si-DNM2转染组内吞的葡聚糖囊泡数量和平均荧光强度与si-NC组比较变化不明显,转染si-DNM2和Dyngo-4a共处理组与单独si-DNM2转染组比较,Dyngo-4a处理组与抑制剂对照组比较,葡聚糖囊泡数量和平均荧光强度均明显降低。结论Dyngo-4a作为靶向DNM的抑制剂在葡聚糖内吞进BMSC过程中存在脱靶效应。

CAR-T细胞治疗实体瘤的脱靶效应及优化方略

近年嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)发展迅速,在血液系统肿瘤治疗中取得显著疗效。但目前CAR-T疗法在实体肿瘤治疗中仍存在诸多限制,实体肿瘤本身的高度异质性及肿瘤特异性抗原缺乏,是CAR-T研究转向实体瘤治疗的主要障碍,尤其是脱靶效应导致的临床毒性仍是医务研究者目前急需解决的问题。

应用CRISPR/Cas9和Cas9-D10A建立Nsun5基因敲除小鼠模型并分析脱靶效应

目的:为了检测CRISPR/Cas9系统的潜在脱靶效应,分别利用野生型Cas9和切口酶Cas9-D10A构建了RNA甲基转移酶Nsun5基因敲除小鼠模型,并对两种策略得到的F0小鼠进行脱靶分析,以比较两种敲除策略的特异性。方法:针对Nsun5基因第3外显子,设计1对sgRNA,将野生型Cas9 mRNA和切口酶Cas9-D10A mRNA分别同这对sgRNA混合后注入小鼠一细胞期受精卵中,实现靶基因敲除,比较两种Cas9得到的F0代敲除小鼠的脱靶效应。结果:利用CRISPR/Cas9和Cas9-D10A成功建立Nsun5基因敲除小鼠模型,对两种Cas9得到的F0代突变小鼠进行潜在脱靶位点分析,均未检测到脱靶位点的存在。结论:两种策略都成功构建了不含脱靶位点的Nsun5基因敲除小鼠模型,为进一步研究Nsun5的生物学功能打下基础。

缩短 shRNA 的 3′尾与靶标 mRNA 的配对降低脱靶效应

基于对microRNA和短发夹RNA(shRNA)的3′尾功能的理解,提出了一种仅通过缩短shRNA的3′尾与靶标序列的互补长度来降低脱靶效应的方法。此方法可以在不损伤shRNA基因沉默效率的前提下达到降低shRNA脱靶效应的目的,从而有效提高shRNA的基因沉默特异性。此策略不受反义链3′区域序列的限制,可以显著改进RNA干扰设计的规则,一定程度上简化shRNA药物设计中的序列限制,拓宽其作为治疗和诊断工具在医疗中的用途和前景。

siRNA脱靶效应类型与规避策略

小干扰RNAs(small interfere RNAs,siRNAs)能够特异性沉默靶基因,现已广泛应用于阐明基因功能,鉴定药物靶点,开发比目前更有效的治疗药物。然而siRNA脱靶效应(off-target effects,OTEs)导致基因沉默实验中表型效应解释复杂化,引起siRNA治疗毒副作用。与siRNA有关的脱靶效应有microRNA样脱靶效应、免疫刺激、RNAi元件饱和三种类型。综述了siRNA脱靶效应类型及减轻脱靶效应的方法,以增强该技术的实用性。

CRISPR基因编辑的脱靶效应应对策略综述

CRISPR/Cas9基因编辑系统是第三代基因编辑技术,在生物医学领域有着广泛的应用。该系统由sgRNA和Cas9蛋白组成,sgRNA与Cas9结合并引导Cas9到达DNA靶点,Cas9作为核酸内切酶对靶序列进行切割,形成DNA双链断裂(double strand break, DSB)。DSB通过两种机制——非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重组介导的修复(homology-directed repair, HDR)——进行修复,实现特定基因的敲除或插入。与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等基因编辑工具相比,CRISPR/Cas9在简便性、专一性等方面有很大优势,但脱靶效应一直是它在实际应用中面临的一个难题。目前已有许多针对脱靶效应的研究,科学家们已发现一些影响靶点专一性的因素,如sgRNA种子序列、PAM序列、Cas9蛋白、DSB修复通路等,并据此研发出降低脱靶效应的可行性策略。本综述就CRISPR/Cas9系统的作用原理、潜在的脱靶危害和降低脱靶效应的策略研究进行阐述。

系列问答147——什么是药物的脱靶效应?

药物靶点为药物与生物大分子的结合部位,包括受体、酶、离子通道、转运体和基因等。科学家们一直期望药物仅作用于疾病治疗相关的靶点,而不与药物设计之外的靶点产生作用(即脱靶效应)。脱靶效应又称为药物副作用,虽然药物的脱靶效应通常是设计者不期望且对患者有害的,但有时也可能使患者获益从而产生新的适应证。Jackson等报道,受试者在服用原本用于治疗心绞痛的西地那非时出现阴茎勃起。利用该药的这一副作用可治疗性功能障碍,西地那非也因此改变了适应证。

CRISPR/Cas9系统的脱靶效应及其介导的非编码RNA编辑在人类癌症中的应用

成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR蛋白9(Cas9)系统作为细菌对抗外源入侵DNA的防御机制已经被成功开发应用于真核生物基因组编辑,该系统具有高效准确且可以编辑任意DNA位点的特点,同时也存在较为严重的脱靶效应。癌症目前对于人类依然是严峻挑战,癌症治疗过程中的不良反应使患者十分痛苦,CRISPR/Cas9系统可能实现在基因水平治疗癌症。本文旨在探讨CRISPR/Cas9系统的脱靶效应,为肿瘤治疗的深入研究提供新思路。

采用蛋白组学技术分析质粒介导siRNA的“Off-target”效应

siRNA的"脱靶效应"(off-target effects)是RNA干扰应用研究领域的热点问题.采用蛋白组学技术对质粒介导的siRNA稳定沉默原癌基因c-myc可能存在的"off-target"效应进行初步研究,为siRNA靶向特异性的系统评价奠定理论与实验基础.构建靶向c-myc的siRNA真核表达质粒p-Mat01-1及其错配质粒p-Mis09-1,空质粒pEGFP-C1为对照,并稳定转染MCF-7人乳腺癌细胞.通过RT-PCR和Western印迹分析结果显示p-Mat01-1稳定转染克隆中c-myc/c-MYC的表达降低.采用2-DE及LC-ESI-MS/MS等方法,研究了p-Mat01-1与pEGFP-C1稳定转染克隆的蛋白组表达差异.结果显示,p-Mat01-1稳定转染克隆中有47个c-myc非调控蛋白点表达升高或降低,约占423个随机检测蛋白点的11.1%.这些蛋白涉及细胞骨架、代谢、增殖、信号传导、分子伴侣、氧化还原等多条途径.实验结果表明,质粒介导靶向c-myc的siRNA在MCF-7细胞中存在明显的"off-target"效应,提示在设计siRNA实验及应用研究时应系统考察其靶向特异性.

CRISPR系统脱靶解决策略的专利分析

CRISPR系统是基因编辑最新、最有效的系统之一,由于其精准性和高效性,使基因编辑变得方便、快速。然而,除了所需的编辑之外,使用CRISPR系统还会产生脱靶效应。本文针对CRISPR系统脱靶相关的国内外专利文献进行检索、收集、统计及分析,综述了CRISPR系统脱靶相关的专利申请量、申请人分布及国别分布的特点,详细分析了关于CRISPR系统脱靶问题的主要技术路线,为CRISPR系统脱靶问题的研究提供参考意见。

“GOTI”技术让基因编辑脱靶无处遁形

[本刊讯]中国科学院神经科学研究所中国科学院灵长类神经生物学重点实验室杨辉研究组与中国科学院计算生物学研究所等单位合作,建立了一种新型基因编辑脱靶检测技术,名为'二细胞胚胎注射法全基因组脱靶分析'(genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection, GOTI),并用该技术发现单碱基编辑有可能导致大量无法预测的脱靶.