基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究

CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明,2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。

CRISPR/Cas9基因编辑系统应用于非人灵长类细胞及胚胎Rb1基因编辑的研究

目的探索聚簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统对于食蟹猴细胞及胚胎基因组视网膜母细胞瘤抑癌基因(Rb1)的编辑效率,旨在进一步建立视网膜母细胞瘤模型。方法查阅RB1突变数据库(http://rb1-lsdb.d-lohmann.de),确定视母细胞瘤发生发展相关Rb1基因外显子区主要有8号外显子;利用DNAman检测人类与食蟹猴基因组中Rb1基因中与是否存在单核苷酸多态性(SNP);通过http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html设计并合成sgRNA;采用CRISPR/Cas9基因编辑系统转染食蟹猴成纤维细胞,并提取转染后细胞基因组以检测合成的sgRNA敲除效率;酶切实验检测转染的细胞是否发生突变,并利用单克隆分析测定具体敲除效率。进一步利用显微操作技术注射sgRNA和Cas9 nuclease混合物(RNP)入单细胞胚胎,检测胚胎水平Rb1基因编辑效率。结果 RNP转染后的食蟹猴成纤维细胞提取基因组检测,发现其中有75%的细胞发生基因突变,且基因编辑类型多样,以碱基缺失突变为主;在胚胎水平上获取4-细胞期胚胎,检测单个卵裂球基因组序列发现,存在突变的胚胎占所有胚胎的36.4%,其中纯合突变比例为18.2%,嵌合突变比例同为18.2%。利用软件预测脱靶位点12个,进行序列测定,结果未发现脱靶。结论在非人灵长类细胞及胚胎水平上,CRISPR/Cas9基因编辑系统对于食蟹猴Rb1基因编辑有效,并且敲除效率较高,进一步利用基因编辑方法建立视网膜母细胞瘤模型研究中,可以作为有效的基因编辑手段。本研究得到的食蟹猴胚胎Rb1基因的编辑效率及胚胎囊胚率为建立视网膜母细胞瘤模型提供了参考。

利用rBE3和rBE4系统进行水稻基因单碱基编辑的特异性和遗传稳定性分析

对基于rBE3(Rice base editor)和rBE4碱基编辑系统创制获得Os SERK1(D428N)和pi-ta(S918F)等基因的单碱基编辑突变体材料进行编辑特异性和遗传稳定性分析,旨在全面了解和更好地利用该碱基编辑系统。首先对Os SERK1(D428N)和pi-ta(S918F)sg RNA的潜在脱靶位点进行预测,并对T0代材料中的各脱靶位点进行PCR扩增和Sanger测序检测;同时对该两个基因的突变体材料自交获得的T1代植株的靶位点序列和外源T-DNA分离进行检测。结果显示各T0代材料均未检测到潜在脱靶位点发生单碱基编辑;此外,Os SERK1(D428N)和Os08g07774含有相同的sg RNA位点,且两个位点均能发生单碱基编辑;rBE3或rBE4系统介导产生的碱基编辑可稳定遗传至T1代,并在T1代可获得无外源T-DNA的纯合突变体。上述结果表明由rBE3或rBE4介导的碱基编辑具有较高的特异性,可进行多位点编辑,引入的碱基替换可稳定遗传至后代。