家猪脱髓核细胞基质的制备及其生物相容性评价

目的:制备家猪脱髓核细胞基质并评价其生物相容性。方法:分离家猪脊柱髓核组织,并逐步经过胰酶、核酶及TritonX-100处理,得到脱髓核细胞基质,DAPI染色观察脱细胞效果及扫描电镜观察脱髓核细胞基质的物理形态特点,将脱髓核细胞基质溶于醋酸,制备成脱细胞基质膜,将大鼠骨髓间充质干细胞接种于基质膜上培养。在第1~5天采用CCK-8检测骨髓间充质干细胞在脱髓核细胞基质膜上的增殖情况,并计算细胞相对增殖率(RGR)来评价其生物相容性。结果:制备出的家猪脱髓核细胞基质肉眼呈白色糜状,DAPI染色发现无细胞残留。扫描电镜下观察发现,脱髓核细胞基质由无序排列的胶原纤维组成。通过CCK-8检测,5d内细胞毒性分级在0级与2级之间。结论:家猪正常髓核组织能够进行脱细胞处理,且脱细胞后由无序的胶原纤维组成。脱髓核细胞基质具有很好的生物相容性,符合生物工程支架选材标准。

不同退变程度人髓核脱细胞外基质支架的生物学特性研究

目的:探索不同退变程度(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ度)人髓核脱细胞外基质(nucleus pulposus decellularized extracellular matrix,NP-dECM)支架的生物学特性,并选取出生物学特性最优的NP-dECM支架。方法:采用Ⅱ型胶原酶消化法提取人髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPMSCs),镜下观察人NPMSCs贴壁、细胞形态及生长情况,行流式细胞术检测细胞表面标志物CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR,并进行成脂、成骨、成软骨诱导分化,观察人NPMSCs的三系分化能力,以确定其为本研究所需要的种子细胞。采用物理、去污剂联合核酸酶法制备不同退变程度的人NP-dECM支架(分别为Ⅱ-D、Ⅲ-D、Ⅳ-D组)。通过肉眼观、DNA及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)成分的定量和定性检测、扫描电镜等对比,评价不同退变程度的人NP-dECM支架脱细胞的效果。并运用CCK-8法和活/死细胞染色体外评估不同退变程度人NP-dECM支架的细胞相容性。结果:从髓核组织分离培养的人NPMSCs贴壁生长,细胞呈短梭形、纺锤形,第3代人NPMSCs高表达CD73、CD90、CD105等表面标志物,低表达CD34、CD45、HLA-DR等表面标志物,同时人NPMSCs具有成脂、成骨和成软骨分化能力,符合间充质干细胞标准。三种退变程度的人NP-dECM支架肉眼观形态保持完好,电镜下各组支架疏松多孔。HE染色、DAPI染色及DNA测定结果显示三种退变程度的人NP-dECM支架均有效去除了细胞成分。GAG和HYP定量及定性检测结果均显示ECM成分保留良好,GAG保留量从高到低依次为Ⅱ-D组>Ⅲ-D组>Ⅳ-D组,Ⅱ-D组和Ⅲ-D组HYP含量差异无统计学意义,均高于Ⅳ-D组。CCK-8及活/死细胞染色结果表明Ⅱ-D组、Ⅲ-D组和Ⅳ-D组均表现出良好的细胞相容性。结论:Ⅱ度退变的人髓核组织为制备人NP-dECM支架最佳选择。

自体骨髓间充质干细胞复合髓核脱细胞基质修复椎间盘退变的实验研究

目的探讨自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)辅以髓核脱细胞基质(DNPM)的细胞治疗作用。方法在本研究中,我们制作了一种优化的DNPM并通过评估其生化组成、水含量、生物安全性和力学性能来评估其性能。进一步研究DNPM在体外对BMSCs的NP样分化的刺激作用,以及在体内动物模式下,对退变椎间盘髓核的再生作用。实验分组:(1)sham组:非椎间盘损伤组;(2)退变组:椎间盘退变造模后未处理;(3)BMSCs组:椎间盘退变单纯注射BMSCs;(4)复合组:椎间盘退变注射BMSCs复合DNPM。结果4周后,约68%和43%的胶原蛋白和sGAG分别保留在NPCs中。NPCs也表现出与新鲜NP相似的力学性能。此外,NPCs具有生物相容性,能够诱导椎间盘退变(IVDD)中髓核样分化和细胞外基质(ECM)的合成。在体外实验中,12周后,复合组的椎间盘高度指数(DHI)(近81%)和MRI指数(349.05±38.48)显著高于造模组,接近sham组。NPCs还部分恢复了体内退化NP组织的ECM含量和结构。结论自体BMSCs辅以DNPM具有良好的生物和力学性能,并具有促进退化NPCs再生的能力,对椎间盘退变有较好的修复能力。

新型一体化纤维环-髓核双相支架的制备与评估

目的用脱细胞脱钙骨基质和脱细胞髓核基质构建新型一体化纤维环-髓核双相支架,并进行理化检测,探讨其作为组织工程椎间盘支架的可行性。方法取猪股骨近端松质骨,塑形成外径10 mm、内径5 mm、厚3 mm的骨环,经脱脂、脱钙、脱细胞处理制备成纤维环相支架;取猪尾髓核组织,Triton X-100和脱氧胆酸联合脱细胞后粉碎、离心,制备脱细胞髓核基质;将制备的脱细胞髓核基质注入纤维环相支架中央,冷冻干燥,联合应用紫外照射和碳化二亚胺进行交联,制备一体化纤维环-髓核双相支架。通过大体观察、HE染色、扫描电镜观察支架结构;测定支架的孔隙率、吸水率、压缩弹性模量;MTT法检测25%、50%、100%支架浸提液对新西兰大白兔脂肪来源干细胞(adipose-derived stemcells,ADSCs)增殖的影响;将ADSCs接种到支架上,活/死细胞染色观察细胞在支架上的活性。结果大体观察支架呈乳白色;HE染色可见支架均质红染,无细胞成分残留;扫描电镜可见外层纤维环相支架孔径大小均匀一致,孔隙相互贯通,中央脱细胞髓核基质微丝相互连接,形成均匀网状结构,交界处连接紧密。纤维环相支架孔径为(343.00±88.25)μm,一体化纤维环-髓核双相支架孔隙率为82.98%±7.02%、吸水率为621.53%±53.31%,压缩弹性模量为(89.07±8.73)kPa。经MTT测定支架浸提液对ADSCs增殖无影响;活/死细胞染色可见细胞在支架上生长良好,无死细胞。结论用脱细胞脱钙骨基质和脱细胞髓核基质构建的一体化纤维环-髓核双相支架具有合适的孔径和孔隙率且无毒,力学性能与人正常椎间盘接近,是构建组织工程椎间盘的理想支架载体。