宏转录组测序揭示褐土脲酶基因的表达丰度和细菌来源

为明确褐土中脲酶编码基因的表达丰度,通过土壤RNA提取和宏转录组测序法,筛选RNA水平上表达较高的脲酶基因,共筛选到122个脲酶结构基因(93个ureC、16个ureB和13个ureA)和脲酶辅助基因115个(29个ureD、12个ureE、36个ureF、29个ureG、5个ureH和4个ureJ)。其中ureB、ureA、ureG、ureH和ureJ所有转录本TPM值都小于2,而ureC、ureD、ureE和ureF丰度最高的转录本TPM值分别为3.17、5.37、2.01和2.71。细菌来源的芽孢杆菌属Bacillus、芽孢八叠球菌属Sporosarcina、节杆菌属Arthrobacter、链霉属Streptomyces和类芽孢杆菌属Paenibacillus等在褐土脲酶活性的发挥中贡献度较大。

PCR法扩增脲酶B基因在快速诊断幽门螺杆菌感染中的应用研究

应用基于幽门螺杆菌脲酶B基因的引物建立了检测幽门螺杆菌的PCR方法。56份内窥镜胃组织标本中，细菌培养阳性34份，PCR阳性36份；172份用自制采样器所取的胃粘液标本中，PCR阳性106份，其中经组织培养HP阳性的34例患者的胃粘液标本PCR均阳性。研究结果提示，PCR方法扩增脲酶基国检测幽门螺杆菌具有快速、简便、准确的优点，在幽门螺杆菌感染的快速诊断、疗效观察、复发机理和流行病学调查研究中均有重要价值。

细菌脲酶蛋白复合物UreABC的表达与纯化

细菌脲酶能分解尿素为氨,在瘤胃尿素氮代谢中发挥重要作用。为了表达纯化并研究蛋白脲酶复合物UreABC,通过PCR扩增脲酶基因簇的结构基因ureA、ureB、ureC,将ureB构建在含有N端His标签的pet28a+载体,ureA、ureC基因共同构建在含有N端His标签的表达载体pETDuet-1,经酶切及测序鉴定得到正确的阳性克隆后,将两个质粒共同转化到大肠埃希菌BL21感受态细胞,利用IPTG诱导表达UreABC融合蛋白。采用SDS-PAGE凝胶电泳对蛋白表达进行鉴定,再通过蛋白纯化仪的镍柱、脱盐柱、分子筛纯化目的蛋白。结果显示,成功构建了两个原核表达载体pET28a-ureB、pET-ureC&A,脲酶基因ureA、ureB、ureC片段大小分别为313、315、1701 bp,以可溶性形式表达脲酶蛋白复合物,并通过纯化得到约240 kD的蛋白。通过脲酶活性测定试验发现,镍离子可以体外激活脲酶蛋白。通过原核表达系统成功表达和纯化了具有活性的脲酶蛋白,为研究蛋白结构以及其与辅助蛋白互作提供参考。

新型聚乙烯醇微囊的制备及其结构性能研究

采用低温物理交联法制备新型聚乙烯醇微囊,所得微囊机械强度好,克服了目前普遍采用的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊易碎的缺点,在APA微囊已完全破碎的机械强度下,聚乙烯醇微囊的破碎率仅为3%.在体外模拟肠胃生理极限条件下可保持稳定的物理化学性质,对尿素、尿酸和肌酐等小分子具有良好的通透性,能在10min内完全通透.将高效分解尿素的脲酶基因工程菌E.coliDH5包埋于聚乙烯醇微囊之中,其工程菌仍具有很高的分解尿素能力,其活力约为自由菌的80%.

金黄色葡萄球菌核酸酶A与不同外源DNA片段融合表达的作用比较

金黄色葡萄球菌核酸酶A(Staphylococcal nuclease A,SNA)可用于菌蜕制备中宿主菌的进一步灭活及残存遗传物质的去除。关于SNA在去除了信号肽后是否仍能分泌至胞外以及是否需要融合其他氨基酸片段才能在宿主菌胞质中发挥作用尚存争议。为厘清这一争议,分别构建一系列含SNA、SNA与λ噬菌体cro基因或结核杆菌脲酶基因部分序列的融合片段c SNA或u SNA的温控质粒并对其在大肠杆菌内的作用进行评价。结果显示,SNA、c SNA和u SNA的表达产物对大肠杆菌的4 h灭活率分别为99.9%、99.8%和74.2%。升温诱导30 min后,SNA和c SNA即可在宿主菌胞内被检出,而u SNA需1 h;相较之下,SNA和c SNA在培养液上清中的被检出时间要晚1 h,u SNA则晚2 h。对三者的核酸酶活性检测均为:SNA﹥c SNA﹥u SNA,且胞外活性都显著低于胞内。此外,SNA和c SNA在诱导2 h后即将宿主基因组成功降解,而u SNA则在整个实验期间均未能使宿主基因组完全降解。这表明SNA、c SNA和u SNA的表达产物均具有核酸酶活性,可被动释放至胞外,外源DNA片段的融入反而会降低SNA的核酸酶活性。