犬脾细胞白介素-18(IL-18)基因的克隆与序列分析

为了研究白细胞介素_1 8(IL_1 8)的活性和功能 ,将犬脾细胞经ConA诱导 ,用TRIzol裂解 ,提取总RNA ,通过反转录聚合酶链反应 (RT_PCR)扩增出犬IL_1 8的cDNA ,然后连接到pMD1 8_T载体上 ,转化DH5α感受态细胞 ,获得阳性重组质粒。核苷酸序列结果表明 ,我们得到了长 686bp的基因 ,含有一个 5 82bp的开放阅读框架 ,编码 1 93个氨基酸。与已知犬序列同源性可高达 99.6% ,与已知猪序列的同源性为 89.8% ,所克隆基因为今后进一步研究IL_1 8基因的功能奠定了基础。

IL-18基因修饰增强肿瘤抗原多肽致敏的树突状细胞体内诱导的抗肿瘤免疫反应

目的 :研究肿瘤抗原多肽致敏的白细胞介素 18(IL 18)基因修饰的树突状细胞体内诱导的抗肿瘤免疫反应。方法 :①以Lewis 3LL肺癌细胞特异性抗原肽mut1冲击致敏IL 18基因修饰的骨髓来源的树突状细胞 (DC IL 18 mut1) ,每次用其 1× 10 5 只皮下免疫小鼠 2次 ,然后测定脾细胞的NK活性及CTL杀伤活性 ;②以DC IL 18 mut1每次 2× 10 5 只皮下免疫 1次 ,然后再以 5× 10 53LL细胞攻击 ,在诱导及效应阶段分别以单抗阻断不同免疫成份 ,观察肿瘤的生长。结果 :以DC IL 18 mut1皮下免疫后可诱导出比DC mut1等免疫组更高水平的 3LL肺癌细胞特异性CTL ,并使NK活性明显增加 ;单抗体内阻断实验提示在DC IL 18 mut1免疫诱导阶段 ,CD4 + T细胞和抗原共刺激分子、IFN γ均起到重要作用 ,而效应阶段CD8+ T、IFN γ、NK起作用 ,而CD4 + T则是非必需的。结论 :DC IL 18 mut1皮下免疫后可诱导高水平的抗肿瘤免疫活性 ,其机理与抗原有效提呈、特异性CTL诱导、NK活性增加以及CD4 + 、CD8+ T、NK细胞、IFN γ参与密切相关。

罗曼鸡胚脾细胞白介素-18基因的克隆与序列分析

根据国外已发表的鸡白细胞介素 18(IL- 18) c DNA基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT- PCR技术 ,从鸡新城疫 系病毒接种 4 8h左右的罗曼鸡胚脾细胞中扩增出鸡 IL - 18全基因 ,并进行了序列测定。结果表明 ,扩增片段全长 5 94 bp,共编码 198个氨基酸的前体蛋白 ,其中含有表达完整功能蛋白所必需的起始密码子和终止密码子。该序列与国外报道的鸡 IL - 18全基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为 99.8%和 10 0 % ;序列中编码成熟蛋白的这段基因与国内报道的源自白来航鸡编码 IL- 18成熟蛋白的基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为 99.8%和 99.4 %。本研究为鸡 IL - 18的扩增及其他细胞因子的扩增提供了一种简便易行的新方法 ,为进一步研究IL- 18基因的结构、功能。

IL-18基因转染对小鼠卵巢癌OVHM细胞免疫生物学特性的影响

目的分析转染IL-18基因后,小鼠卵巢癌OVHM细胞的IL-18mRNA及蛋白表达、培养上清中IL-18含量、IFN-γ诱生能力等免疫生物学特性的变化,初步探讨IL-18基因转染治疗卵巢癌的应用价值。方法将逆转录病毒携带的小鼠活性IL-18基因转染至OVHM(OVHM/IL-18),以空载体转染的OVHM(OVHM/LXSN)和野生型OVHM作为对照。分别采用RT-PCR及免疫细胞染色法检测3组细胞的IL-18mRNA及蛋白表达;ELISA方法测定细胞培养上清中IL-18的含量、及其诱生小鼠脾细胞产生IFN-γ的能力。结果OVHM/IL-18细胞中可检测到IL-18mRNA及蛋白的表达,而OVHM/LXSN和野生型OVHM细胞中未见表达。OVHM/IL-18细胞可分泌IL-18,于培养24h时达高峰(138.25pg/mL±12.36pg/mL),之后逐渐减弱;OVHM/LXSN和野生型OVHM细胞上清中未检测出IL-18。OVHM/IL-18细胞培养上清诱生IFN-γ的水平明显高于VHM/LXSN和野生型OVHM细胞(分别为33.84pg/mL±2.36pg/mL、18.80pg/mL±1.06pg/mL、18.43pg/mL±2.64pg/mL,P<0.01),VHM/LXSN与野生型OVHM细胞之间未见显著差异(P>0.05)。结论IL-18基因转染可有效提高小鼠卵巢癌细胞IL-18mRNA的表达及其蛋白的合成释放、诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ。IL-18基因转染可纠正肿瘤细胞的IL-18低表达状态,诱导IL-18的抗瘤效应,可能对抑制肿瘤生长、促进肿瘤消退有一定的应用价值。

逆转录病毒介导IL-18基因在大鼠胶质瘤细胞C6中的表达

目的 :建立表达IL 18基因的大鼠胶质瘤细胞C6 /IL 18,并探讨外源性IL 18基因对C6细胞生长的影响。方法 :应用逆转录病毒载体 ,将IL 18基因导入C6细胞。经G4 18筛选后 ,获得表达IL 18分子的细胞克隆C6 /IL 18。用RT PCR法检测目的基因mRNA的表达 ;用流式细胞和免疫细胞化学染色法检测目的蛋白的表达。用ELISA法检测C6 /IL 18细胞培养上清诱导脾细胞分泌IFN γ的能力 ,以确定IL 18的生物学活性。用MTT比色法检测细胞体外增殖的状况 ,用流式细胞技术检测细胞的增殖活性 ,并建立大鼠胶质瘤模型 ,观察C6 /IL 18细胞体内致瘤性的改变。结果 :外源IL 18基因于mRNA水平和蛋白水平可获得稳定表达 ,并可诱生大鼠脾细胞分泌IFN γ。同时 ,该细胞系的体外增殖率及体内致瘤性 ,均较亲代C6胶质瘤细胞明显下降。结论 :外源性IL 18基因能部分地抑制C6细胞的体外增殖率和体内致瘤性。建立了可进一步用于相关肿瘤基因免疫和基因治疗研究的大鼠胶质瘤细胞系C6 /IL 18。

IL-18基因转染对大鼠C6胶质瘤细胞生长特性的影响

探讨IL-18基因转染对大鼠C6胶质瘤细胞生长特性的影响。用MTT法和流式细胞术检测C6/IL-18细胞和C6细胞的增殖特性和细胞周期分布。免疫细胞化学检测C6/IL-18细胞和C6细胞的增殖细胞核抗原(PCNA)、波形蛋白表达。结果显示,与C6细胞相比C6/IL-18细胞的增殖能力降低,G0/G1期细胞增多而G2/M期细胞减少;PCNA、波形蛋白表达降低。研究表明,IL-18基因具有抑制C6胶质瘤细胞增殖、降低其恶性程度的作用。

IL-18基因转染膀胱癌细胞的建立及其抑瘤作用研究

目的将IL-18基因转染膀胱癌细胞(T24),检测该细胞体内外的凋亡变化,探讨IL-18的抗肿瘤作用机制。方法用含IL-18的基因IL-18/PA317转染T24细胞,经G418筛选后获得IL-18/T24阳性克隆。采用RT-PCR鉴定转染细胞mRNA的表达;用ELISA法检测IL-23/MA-891细胞培养上清中IL-18的分泌;用MTT比色法检测细胞体外增殖能力;观察IL-18/T24细胞生长情况、移植瘤的生长情况;用流式细胞技术检测体外和体内的细胞凋亡率。结果成功将IL-18基因转染T24细胞获得高表达IL-18细胞IL-18/T24。转染IL-18基因不影响T24细胞的体外生长和细胞凋亡,但体内IL-18基因转染组肿瘤生长明显受到抑制,肿瘤组织细胞凋亡率增高(P<0.01)。结论转染IL-18基因后对膀胱癌细胞(IL-18/T24)的体外凋亡无影响,但在体内IL-18能够诱导细胞凋亡,产生抗明显肿瘤作用。

白细胞介素-18基因修饰的胎肝细胞经脾移植对小鼠免疫功能的影响

目的 :观察表达 m IL- 18的重组腺病毒基因修饰的胎肝细胞 (Adm IL- 18/ BNL.CL2 )经脾移植对正常小鼠免疫功能的影响。方法 :实验组小鼠经脾移植 Adm IL- 18/ BNL.CL2 ,同时设 Lac Z病毒对照组 (Ad- Lac Z/ BNL.CL2 ) ,BNL.CL2 细胞对照组及空白对照组。2周后处死 ,留取血清 ,制备腹腔巨噬细胞、脾淋巴细胞、肝组织匀浆液 ,提取肝组织总 RNA。采用 ELISA法检测各组小鼠血清、腹腔 Mφ和脾细胞培养上清、肝匀浆中细胞因子的含量 ;采用半定量 RT- PCR法 ,检测肝组织细胞因子 m RNA相对表达量 ;以 LDH释放法测定腹腔 Mφ杀伤活性和脾 NK细胞活性 ,用 MTT还原比色法测定脾淋巴细胞的增殖活性。结果 :实验组小鼠血清、细胞培养上清及肝匀浆中 ,IL- 18、IL - 2、IFN-γ、TNF-α含量均高于其它对照组 ,而 IL - 4、IL - 10水平则低于对照组 ;半定量 RT- PCR结果与EL ISA检测结果一致 ;同时 ,实验组腹腔 Mφ的杀伤活性和脾 NK细胞活性 ,及脾淋巴细胞增殖活性也明显高于对照组。结论 :Adm IL - 18能有效转染至胎肝细胞并稳定表达 m IL- 18;Adm IL - 18基因修饰的胎肝细胞经脾移植后 ,可显著提高肝脏、脾脏免疫细胞活性 ,活化腹腔 Mφ,促进 Th1类细胞因子表达 ,抑制 Th2类细胞因子的分泌。

IL-18基因转染人膀胱癌T-24细胞及其表达的研究

目的:建立表达IL-18基因的人膀胱癌细胞系IL-18/T-24,探讨外源性IL-18基因对T-24细胞生长及其生物学性状的影响。方法:将插入IL-18基因的质粒,应用逆转录病毒载体LXSN感染ψ2(ecotropic)和PA317(amphotropic)两种包装细胞,通过药物G418筛选获得表达IL-18蛋白的PA317阳性细胞克隆,用IL-18/PA317培养上清转染T-24细胞,获得表达IL-18的IL-18/T-24细胞。分别用RT-PCR、ELISA和免疫组化染色分析IL-18/T-24细胞表达IL-18的mRNA和蛋白的水平,筛选出高表达IL-18的IL-18/T-24细胞克隆用于下层研究中;用流式细胞仪检测转染前后细胞的周期变化及细胞凋亡情况;用ELISA法检测IL-18/T-24细胞培养上清诱导脾细胞分泌IFN-γ的能力;采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)比色法,测定转染前后细胞增殖及黏附能力的变化。结果:外源性IL-18基因转染的人膀胱癌细胞系IL-18/T-24,在mRNA水平和蛋白水平均可获得稳定表达;并且,IL-18/T-24细胞的培养上清可明显促进小鼠脾细胞分泌IFN-γ(P<0.01)。IL-18/T-24细胞与LXSN/T-24和T-24比较,细胞周期及细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05),IL-18/T-24细胞的增殖率与LXSN/T-24和T-24细胞相比虽有所降低,但无显著性差异(P>0.05)。结论:建立的稳定表达IL-18的IL-18/T-24细胞,既保持了肿瘤细胞原有的免疫原性,又具有分泌IL-18的功能,引起较强的免疫应答反应。IL-18/T-24细胞与LXSN/T-24和T-24细胞相比较,其生物学性状无明显差异,可进一步用于肿瘤相关免疫基因治疗的研究。

IL-18基因的克隆及其在宫颈癌细胞中的表达研究

目的 研究白细胞介素 18(Interleukin -18,IL18)基因能否在宫颈癌细胞 (Hela细胞 )中表达。 方法 从人胎脑RNA中RT -PCR扩增IL -18基因 ,构建真核基因表达载体pcDNA3 1( +) -IL18,并转染到宫颈癌细胞中 ,收集细胞转染后 2 4～ 48h上清 ,Western -Blotting检测IL18基因在宫颈癌细胞中的短暂表达。G418筛选稳定表达IL18基因的单克隆宫颈癌细胞 ,利用RT -PCR、Western -Blotting检测IL18基因在宫颈癌细胞中的稳定表达。研究为三组 :1 空白Hela细胞组 ;2 空载体pcDNA3 1( +)转染Hela细胞组 ;3 pcDNA3 1( +) -IL18传染Hela细胞组。 结果 1 成功克隆IL18基因。 2 成功构建真核基因表达载体pcDNA3 1( +) -IL18。 3 短暂表达结果 :Western -Blotting检测pcDNA3 1( +) -IL18组在 14 4至 2 0 1KDa之间有一特异性条带 ( 18 3KDa) ,空白Hela细胞组和空载体pcDNA3 1( +)组均没有任何条带。 4 稳定表达检测结果 :( 1)RT -PCR结果 :pcDNA3 1( +) -IL18组扩增到一特异性DNA条带 ,位于 75 0至 10 0 0bp之间 ,空白Hela细胞组和空载体pcDNA3 1( +)组均没有扩增到任何条带。 ( 2 )Western -Blotting结果 :pcDNA3 1( +) -IL18组在 14 4至 2 0 1KD之间有一特异性条带 ( 18 3KDa) 。

外源性IL-18基因对C6胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响

目的:研究IL-18基因转染对C6胶质瘤细胞增殖活性及相关基因表达的影响.方法:用流式细胞仪观察C6/IL-18细胞周期、增殖指数的变化;用RT-PCR,蛋白印迹、免疫细胞化学方法分析C6/IL-18细胞cyc lin D1,cyc lin B1,Bc l-2 mR-NA及蛋白的表达.结果:与亲代C6细胞相比,C6/IL-18细胞表现为G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,细胞增殖指数(PI)降低.C6/IL-18细胞的cyc lin D1和cyc lin B1,Bc l-2 mR-NA及蛋白表达降低.结论:外源性IL-18基因可降低C6细胞的增殖活性,其机制可能与Bcl-2,cyclin B1和cyclin D1表达下调有关.

IL-2基因修饰的肝细胞脾内移植增强肝脏免疫功能的实验研究

本实验在已证明Neo基因标记的肝细胞经脾注射后能在肝脏中定位生长、并稳定表达的基础上，进一步探讨细胞因子基因修饰的肝细胞脾内注射后，肝脏中表达的细胞因子对肝脏免疫功能的影响，为肝脏恶性肿瘤的免疫基因治疗提供实验依据。鉴于IL-2能显著增强免疫功能，对肝癌及多种肿瘤肝转移的疗效比较确实，我们选择了IL-2作为本实验的目的基因。

IL-18基因转染对大鼠胶质瘤体内生长及肿瘤细胞凋亡的影响

目的分析转染外源性IL-18基因后9L胶质瘤细胞体内成瘤及对肿瘤细胞凋亡的影响。方法用立体定向技术将体外用逆转录病毒转染IL-18基因的9L胶质瘤细胞(9L/IL-18)、转染空载体的9L胶质瘤细胞(9L/LXSN)及未转染的9L细胞接种到F344大鼠颅内建立实验动物模型,观察各组细胞对大鼠的致瘤性,计算成瘤率;原位末端标记法(TUNEL法)检测肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡情况,计算各组肿瘤细胞的凋亡率;RT-PCR和Westen Blot法检测肿瘤组织中Bax和Bcl-2的表达。结果三组大鼠成瘤率均为100%;TUNEL法检测结果显示,接种9L/IL-18细胞组肿瘤组织内出现大量凋亡细胞,凋亡率为(22.2±1.02)%,明显高于接种9L/LXSN[(5.7±0.32)%]及9L[(6.4±0.51)%]细胞组(P<0.05);接种9L/IL-18细胞组肿瘤组织中Bax的表达较其他两组升高,Bcl-2的表达较其他两组降低。结论 9L胶质瘤细胞转染外源性IL-18基因后,可通过上调Bax的表达,下调Bcl-2的表达促进肿瘤细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。

白血病小鼠经IL-6基因转染瘤苗治疗后脾细胞诱生的细胞因子水平

本文在研究了人白细胞介素6(IL-6)基因转染瘤苗对白血病小鼠体内治疗作用及其部分免疫机理的基础上,进一步观察了IL-6基因转染瘤苗治疗白血病小鼠后产生细胞因子(包括IL-1,IL-2,IFN-γ,TNF及GM-CSF)水平的变化。结果表明,IL-6基因转染瘤苗在体内对小鼠脾淋巴细胞或腹腔巨噬细胞(Mφ)经诱导后分泌的上述细胞因子(除IFN-γ外)各组均有不同程度的促进作用。以此种新型瘤苗辅以低剂量IL-2和低剂量环磷酰胺(Cy)治疗后促进作用最为明显。从而为IL-6基因转染瘤苗治疗白血病的免疫学机理提出了新的认识。

双基因(VP3、IL-18)联合致小鼠骨肉瘤S-180细胞凋亡的效应

目的探讨VP3、IL-18双基因抑制骨肉瘤S-180的联合抑瘤作用。方法将VP3、IL-18基因插入pVAX1表达载体的pCMV启动子之下的EcoRI位点,构建成pVVP3及pVVp3-IL18。将该重组质粒与单独表达凋亡素基因的重组质粒分别注射荷S-180肿瘤细胞的BALB/C小鼠,比较抑瘤趋势和抑瘤率。结果联合应用VP3基因和IL-18基因的重组病毒治疗组的抑瘤率(46.16%)高于单独应用VP3基因组的抑瘤率(19.56%),两组比较有统计学差异(P<0.05)。结论凋亡素基因具有凋亡诱导效应及体内的抑瘤效应。凋亡素基因VP3与IL-18基因有协同抑瘤效应,联合基因治疗骨肉瘤可提高抑瘤效果。

IL-18-PE38融合基因真核表达载体的构建及其在软骨细胞中的表达

目的构建含有白细胞介素-18(IL-18)及毒素融合基因的真核表达载体,并研究其在软骨细胞中的表达情况。方法通过分子克隆技术,将IL-18-PE38融合基因插入真核表达载体PsecTag2B中,构建真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38,经EcoR单酶切及PCR鉴定。脂质体法将其转入原代软骨细胞,通过荧光免疫细胞化学法鉴定其瞬时表达。结果经EcoR单酶切及PCR鉴定证实IL-18-PE38融合基因成功克隆入真核表达载体PsecTag2B中。荧光免疫细胞化学法荧光显微镜照片证实此重组基因可在软骨细胞膜及细胞浆中表达。结论证实了IL-18-PE38融合基因可在软骨细胞中表达,为进一步研究其对类风湿关节炎的治疗奠定了基础。

壳寡糖对体外培养的巨噬细胞IL-18基因表达的影响

目的 :研究壳寡糖对小鼠巨噬细胞IL 18基因转录水平和翻译水平的影响。方法 :将壳寡糖作用于体外培养的小鼠巨噬细胞 ,运用相对定量逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)技术和酶联免疫吸附实验 (ELISA)技术 ,检测壳寡糖对巨噬细胞IL 18基因转录水平和翻译水平的影响。结果 :RT PCR和ELISA结果表明 ,巨噬细胞加入壳寡糖作用 2 4h后 ,IL 18基因转录水平为对照组的 1.7倍 (P <0 .0 1) ,其分泌量为空白对照组的 1.8倍 (P <0 .0 1)。结论 :壳寡糖可以增强小鼠巨噬细胞IL 18的基因表达 ,使细胞因子IL 18基因转录及翻译水平增高。

过氧化氢对小鼠脾细胞IL-2基因表达的影响

应用细胞免疫学和分子生物学的斑点杂交技术，探讨Ｈ２Ｏ２对小鼠脾细胞产生ＩＬ２和ＩＬ２ｍＲＮＡ表达的影响。结果示１０３～１０－２ｍｏｌ·Ｌ１Ｈ２Ｏ２对小鼠脾细胞产生ＩＬ２有抑制作用，并显著低于对照组（Ｐ＜０．０１）；１０－４ｍｏｌ·Ｌ－１有促进作用（Ｐ＜０．０１）；１０－８～１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１则影响不明显。斑点杂交结果示１０－３ｍｏｌ·Ｌ－１Ｈ２Ｏ２对小鼠脾细胞ＩＬ２ｍＲＮＡ表达有抑制作用，１０－４ｍｏｌ·Ｌ－１有促进作用，而１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１影响不明显。

编码鸡IL-18成熟蛋白基因的分子克隆与序列测定

白细胞介素 18(IL_18)是一种能诱导IFN_γ产生的新型细胞因子 ,在调节Th1型细胞免疫应答中起重要作用。本研究根据已发表的鸡白介素 18(IL_18)cDNA基因序列设计引物 ,用反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR)技术从有丝分裂原ConA刺激 4 8小时活化的白来航鸡脾细胞中扩增出编码鸡IL_18成熟蛋白质的基因 ,并进行序列测定 ,并与结果进行了比较 ,发现本研究克隆到的鸡IL_18成熟蛋白编码基因序列在 4 82位为C ,而Schnieder等报道的序列为T ,这一核苷酸序列的变化导致了推导的对应氨基酸残基由苯丙氨酸变为丝氨酸。该处碱基变化的原因究竟是鸡IL_18本身存在多态性 ,还是反转录或PCR过程中的碱基错配所致 ,该处碱基的变化对于鸡IL_18蛋白的表达及其生物活性究竟有无影响等问题正在研究中。该基因为国内首次报道经序列测定证实的鸡IL_18基因 。

白细胞介素18基因修饰的树突状细胞的表型分析及其免疫刺激活性

目的:研究IL-18基因修饰后的树突状细胞(DC)的表型和功能的变化.方法:以含IL-18基因的重组腺病毒体外转染小鼠骨髓来源的DC,RLIDS检测IL-18分泌水平,以RT-PCR检测IL-18mRNA表达,以FACS法分析其DC表型变化,采用TdR检测其MLR的变化.结果:IL-18基因修饰的DC有效分泌IL-18,可检测到IL-18mnRNA的表达,分泌上清具有诱导T细胞产生IFN-γ的作用,IL-18基因修饰的DC同种异体MLR明显增强,且仅能被IL-18抗体部分阻断,表型分析表明,IL-18基因修饰后的Ia,B7.2,ICAM-1太阳性的DC的比例明显增加.结论:IL-18基因修饰的DC可有效表达有功能的IL-18,部分表面分子表达上调,刺激同种异体T淋巴细胞增殖能力的提高,提示其抗原提星功能增强.