腈水解酶立体选择性改造及其合成布瓦西坦

布瓦西坦是新一代抗癫痫药物,具有广阔的市场前景。利用腈水解酶立体选择性催化3-氰基己腈合成关键手性中间体(R)-3-氰基己酸,进一步经加氢、环化、手性拆分等合成布瓦西坦路线,具有原子经济性高等优势,然而目前挖掘的腈水解酶存在立体选择性差等缺陷。以腈水解酶PgNIT为研究对象,通过对其催化口袋和亚基界面改造获得了立体选择性大幅提高的突变体F164W/I202R,产物光学纯度由野生型的86%提升至97%,E值由17提高至111。分子动力学模拟研究表明,F164位点的改造减小了(R)-3-氰基己腈深入催化口袋内部的空间位阻,而“A”界面I202位点的改造增加了亚基之间缔合的距离和催化口袋区域的原子动态协同性,从而显著提升了腈水解酶的立体选择性。

源于Alcaligenes faecalis腈水解酶基因的生物信息学分析

课题组为探究源于Alcaligenes faecalis腈水解酶突变型Mut3基因的结构与功能,以前期研究为基础,具体分析了腈水解酶的生物信息学,包括理化性质、蛋白二级结构、三级结构、蛋白的保守结构域、跨膜区、信号肽、亲水性和疏水性等。腈水解酶的生物信息学分析为其进一步分子改造提供了重要的理论依据。

腈水解酶反应机制与催化性能调控研究进展

腈水解酶是一类能够催化腈类化合物水解生成相应羧酸和氨的酶。因其独特的化学、区域和立体选择性,腈水解酶生物催化在高附加值羧酸等化学品的制备中具有重要应用,代表了原子经济和绿色化学的发展方向,成为生物有机合成中最为活跃的分支之一。本文综述了腈水解酶的来源、催化机制及基于结构功能构效关系的催化性能调控等方面研究进展,展望了腈水解酶的工业应用潜力,为发展腈水解酶设计改造方法、拓展其应用范围奠定基础。

腈水解酶及其镜像突变体与3-取代戊二腈底物结合模型的研究

目的 探析底物3-取代戊二腈在酶活性中心的结合模式。方法 采用分子对接方法,选取4种3-取代戊二腈底物分别与腈水解酶(SsNIT)及其突变体进行分子对接,并对酶-底物结合模型进行分析。结果果3-取代戊二腈底物与腈水解酶突变体具有较强的结合力,其突变体-底物复合物的结合构象更稳定。4种底物分子中,带有芳香环取代基的底物分子与酶活性中心形成较强的π-π相互作用,芳香型底物-酶复合物结合能力最强,构型最稳定。结论 SsNIT及其突变体与不同底物小分子的结合模式存在差异,底物与酶活性中心的相互作用是影响酶底物选择性的关键因素。研究结果为进一步阐明SsNIT催化不同底物去对称性水解的机理及选择性差异提供了一定的理论基础。

微生物酶催化腈水解反应的研究进展

腈的酶法水解不仅反应条件温和 ,而且高效性、高选择性 ,在光学活性羧酸及其衍生物的合成中具有巨大的应用潜力。综述了催化腈水解的酶类、反应类型、反应特性、影响反应的因素及其在工业上的应用前景。

高效催化3-氰基吡啶腈水解酶新菌株的筛选

通过富集培养技术,从土壤中筛选出1株具有较高3-氰基吡啶催化活力的产腈水解酶新微生物。实验主要通过让微生物在以甘油为碳源、腈类化合物为氮源的培养基中生长,达到筛选的目的。当以乙腈为氮源时,从土壤中筛选出具有芳基乙腈水解酶活力的菌株8株,其中2株表现出了对3-氰基吡啶的催化活力;当以3-氰基吡啶为氮源时,从土壤中筛选出具有芳香腈水解酶活力的菌株2株,它们对3-氰基吡啶具有较专一催化活力,其中活力最高的菌株被鉴定属于红细菌属(Rhodobacter),本文首次报道该种属菌株中具有腈水解酶。

腈水解酶的来源、结构、作用机制及其应用

综合报道了腈水解酶的来源、结构、作用机制及其工业应用。

透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在毕赤酵母中的表达研究

为获得高效表达外源蛋白的Pichiapastoris菌株而设计了重组质粒pPIC9K_vgbbxn ,其中透明颤菌血红蛋白基因vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度 ,腈水解酶基因bxn分泌表达。转化GS115菌株后 ,通过PCR、SDS_PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达 ,以及用准确的蛋白活性测定方法成功地检测到二者所表达的产物均具有正常的活性。摇瓶发酵实验证明 。

臭鼻杆菌腈水解酶基因(bxn)的克隆及其在原核生物中的表达

通过PCR技术从克雷伯氏臭鼻杆菌基因组DNA中克隆到编码腈水解酶的基因(bxn),插入pET28a(+)载体的NcoI和SacI之间,构建了bxn基因的原核生物表达载体pET-BX。通过SDS-PAGE鉴定出重组克隆,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出了一种37.7 kD的特异蛋白,其表达量占宿主菌总蛋白的18.2%。在添加终浓度为4mmol/L的乳糖和28℃培养条件下,重组克隆菌可表达较高产量的特异酶蛋白,可将溴苯腈降解为无毒物质,并具有较高活性。

Rhodococcus rhodochrous tg1-A6腈水解酶的表达和催化研究

采用紫外线和氯化锂诱变得到一株名为Rhodococcus rhodochroustg1-A6的菌种,该菌经过培养基和培养条件的优化能够产生高酶活的腈水解酶。优化培养条件为:温度28℃、摇床转速200 r/min、种子培养20 h后以6%接种量接种于产酶培养基,初始pH 7.0,300 mL摇瓶装液量为40 mL。酶活达到21.96 U/mL。在含一定菌体的100 mL反应体系中,经过10 h连续43次补加底物丙烯腈,能使产物丙烯酸的质量浓度累积到414.5 g/L。

产腈水解酶菌株的诱变及培养优化

对实验室保存的1株产腈水解酶的Rhodococcus rhodochrous菌株采用氯化锂进行诱变处理,筛选得到了1株产酶活力较高的菌株tg1-A6。经过优化得到培养基的配方为(g.L-1):葡萄糖10,谷氨酸钠10,酵母膏3,己内酰胺7,MgSO40.5,K2HPO40.75,KH2PO40.75。当培养温度28℃,摇床转速200 r.min-1,初始pH值7.0,通过补加葡萄糖,该菌的腈水解酶酶活可达到26.77 U.mL-1。

恶臭假单胞菌腈水解酶的生物催化特性

以丙烯腈为底物,对产腈水解酶菌株Pseudomonas putida XY4在静息细胞状态下的催化特性进行了研究,考察了p H、温度、金属离子、底物浓度对酶的影响,以及该酶的p H与温度稳定性、底物特异性等,同时对丙烯腈的生物转化过程进行考察。结果表明,腈水解酶的最佳催化条件为p H=7.2,30℃,底物浓度150 mmol/L;Ag+、Cu2+和Fe3+对酶具有强烈的抑制作用;该腈水解酶对3-氰基吡啶等芳香族杂环腈具有较高的特异性,其次是甘氨腈和丙烯腈,对酰胺类物质无特异性。该研究对利用腈水解酶生物催化丙烯腈制备丙烯酸的应用提供借鉴。

一种腈水解酶的高通量筛选方法

水解腈的酶类(腈水解酶或腈水合酶/酰胺酶)在制药行业中生产有机羧酸及其衍生物方面有着广泛的应用,为了获得较多的酶源,建立高通量筛选方法是非常必要的。今利用改进的羟肟酸铁分光光度比色法建立了一种简单、快速、高通量的筛选方法,同时利用产酶菌株Rhodococcus sp.CCZU10-1静息细胞催化反应来进行方法的准确性验证。并且通过与液相色谱法检测结果进行对比,结果表明羟肟酸铁比色法对有机羧酸的检测具有较高的准确性。因此,建立的高通量筛选方法在产腈水解酶微生物筛选及应用方面有很大应用前景。

腈水解酶在羧酸合成中的研究进展

有机羧酸是有机合成中的重要中间体,用腈水解酶催化有机腈实现有机羧酸的合成不仅具有反应条件温和、污染少和易处理等优点,而且更重要的是能实现一般化学法所不能达到的高度化学、区域和立体选择性。综述了腈水解酶的来源、特性和作用机理,介绍了腈水解酶在有机合成中的研究进展以及该酶在工业上的应用前景。

诺卡氏菌株C-14-1中腈水解酶基因的鉴定、测序及分析

从腈纶废水中分离到高效降解多种污染物的诺卡氏菌株C-14-1,并对该菌中腈水解酶的基因进行鉴定和测序.利用红球菌中腈水解酶氨基酸保守区设计核苷酸引物,以菌株C-14-1的总DNA为模板,PCR扩增发现一条预期大小的DNA带.Southern杂交显示基因组中存在一个腈水解酶基因.进一步构建基因文库和菌落原位杂交,克隆到一个约4·5kb的DNA片段.DNA序列测定和分析表明,该DNA片段携带长度为1143bp的腈水解酶基因.比对分析表明,该基因与国际上发表的红球菌和诺卡氏菌中的腈水解酶基因高度相似.

重组真菌腈水解酶的发酵工艺条件及生物催化特性初探

对产真菌腈水解酶的重组大肠杆菌的培养基种类、培养基成分、诱导剂种类和浓度、诱导条件、p H和温度进行了系统考察。摇瓶发酵优化结果显示:以甘油作为主要碳源,蛋白胨和酵母膏作为主要氮源,并添加微量元素的SOC培养基作为发酵培养基,最适接种量为0.5%;较优的诱导剂诱导条件为:采用0.5 mmol/L的IPTG诱导12 h,发酵p H=7.5,诱导温度25℃时产酶效果最佳。经过优化后,重组酶的酶活得到了显著提高,总酶活最高达到了3.84 U/m L,相比初始水平(0.84 U/m L)提高约4倍。5 L发酵罐的放大实验表明,产酶效果良好,总酶活和比酶活均与摇瓶水平基本持平。全细胞催化性质考察研究结果表明,该菌株所产腈水解酶催化反应的最适催化反应温度是45℃,最适反应p H约为7.2。

水稻腈水解酶家族的生物信息学分析

为了更好地了解水稻腈水解酶家族的功能,采用生物信息学的方法对水稻中的腈水解酶进行了一系列分析,结果发现水稻中共有8个编码腈水解酶的基因,虽然基因结构很不相同,但其所编码的腈水解酶都具有典型的碳氮水解酶结构域和保守的Glu-Lys-Cys催化三联体。通过EST搜索发现这些基因在水稻不同组织和不同胁迫条件下的表达情况存在较大的差异。此外,对水稻和拟南芥腈水解酶进行系统进化分析发现其分别处于5个不同的分支,表明它们的分化早于单子叶植物和双子叶植物的分化。研究结果为进一步研究该类蛋白的分子和生物学功能奠定了良好基础。

腈水解酶产生菌游离细胞催化特性的初步研究

从自然源筛选到的一株腈水解酶产生菌乳酪短杆菌（Brevibacterium casei），能够高选择性地将腈转化为羧酸，初步研究了该菌株所产的腈水解酶在游离细胞形态下的催化特性，包括热稳定性、pH稳定性、金属离子和添加剂的作用、溶剂耐受性及底物特异性等。结果表明：酶在45℃和pH6．8条件下表现出最高催化活性，在20℃和pH6．5～8．5下酶活稳定，Mg^2＋和Mn^2＋对酶活性有轻微的促进作用，但Fe^3＋、Cu^2＋、Al^3＋和Sn^2＋强烈抑制酶，表面净陛剂OP、NP10及RS010有促进酶活作用，十二烷基磺酸钠却产生较强抑制作用，L-半胱氨酸能够减弱重金属离子对酶的抑制。该酶对芳香族腈、脂肪族腈、饱和腈与不饱和腈均能作用，并具有较好的对映体选择性。有机溶剂会使酶失活，但酶对甲醇具有一定的耐受性，在6％（V／V）浓度下，20h后酶的残留活性为98．8％。

Arthrobacter nitroguajacolicus腈水解酶基因的克隆和表达

腈水解酶是一类能将腈类化合物催化生成酸的氰基水解酶。目前已有多个菌种的腈水解酶基因序列被报道,如敏捷食酸菌Acidovorax facilis,粪产碱菌Alcaligenes faecalis,睾丸丛毛单胞菌Comamonas testoteroni,肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae,假单胞菌Pseudomonas属菌株,红球菌Rhodococcus属菌株,但节杆菌属菌株Arthrobacter nitroguajacolicus的腈水解酶基因序列尚未见报道。经由野生型酶的分离纯化,基因文库筛选及侧翼序列扩增等步骤,克隆得到该菌株的腈水解酶基因,从而为进一步研究该酶的特性及构建用于工业生产的重组菌打下基础。

Rhodococcus rhodochrous tg1-A6腈水解酶催化3-氰基吡啶合成烟酸的研究

利用高产腈水解酶的菌株Rhodococcus rhodochrous tg1-A6催化3-氰基吡啶合成烟酸,实验结果表明,腈水解酶的最适底物浓度为130mmol/L,最适催化温度为55℃,最适pH值为pH7.0.经过15h连续补加底物3-氰基吡啶,反应体系中产物烟酸的浓度可达到165.2g/L.在产物浓度累积不高的情况下,菌体经过7批次(共67h)的催化,烟酸的最终质量浓度累计可达到529g/L.