预防刺参腐皮综合征复方中药的筛选及体内药效评价

为开发防治刺参腐皮综合征的复方中药,从14种中药中筛选出对灿烂弧菌(Vibrio splendidus)有明显抑制作用的单味中药,并通过正交实验确定最佳抗菌复方FF-Z(诃子﹕五倍子﹕穿心莲﹕川芎=15 g﹕2 g﹕10 g﹕5 g)。在饲料中分别添加10、20、30和40 g/kg的复方FF-Z作为试验组,不含复方FF-Z的饲料为对照组,并以含恩诺沙星粉20 g/kg的饲料为药物对照组,连续投喂刺参10d,继而用终浓度为10^(7) CFU/mL的灿烂弧菌进行浸浴攻毒,以观察预防保护效果。结果显示,灿烂弧菌对复方FF-Z极敏感,抑菌圈直径可达(23.10±0.62)mm,最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)值分别为7.81和15.63 mg/mL;与阴性对照组相比,复方FF-Z各剂量组刺参的SOD、ACP和AKP活性显著提高,且优于药物对照组。在灿烂弧菌感染后,复方FF-Z各剂量组处理的刺参发病时间比阳性对照组推迟2d,其中复方FF-Z 20 g/kg组、FF-Z 30 g/kg组和FF-Z 40 g/kg组刺参的20d发病率分别为22.08%、22.14%和14.58%,显著低于阳性对照组的84.45%。组织病理学观察结果表明,添加30 g/kg复方FF-Z的饲料能够有效减轻灿烂弧菌入侵引起的刺参组织炎症反应,从而起到保护作用。研究证明,复方FF-Z能够显著提高刺参的免疫和抗病力,对灿烂弧菌引起的腐皮综合征具有良好的预防保护效果,能延缓该病的发病进程并降低发病率。

杨树响应腐皮镰刀菌侵染的转录组学分析

[目的]基于RNA-Seq测序技术,初步探究了杨树-腐皮镰刀菌互作过程中相关基因的表达、主要信号通路和代谢途径,筛选了杨树防御腐皮镰刀菌侵染的关键基因,为进一步揭示此类病害的分子机制奠定基础。[方法]以生长2个月的银腺杨84K为材料,用1×10^(7)个·mL^(-1)的腐皮镰刀菌孢子液侵染根系,于侵染0h(对照组)、48 h和72 h(接菌组)后取根组织进行转录组测序,挖掘杨树响应腐皮镰刀菌侵染的相关基因。[结果](1)与对照组0 h相比,侵染48 h和72 h分别检测到8 939个和8 246个DEGs(Differentially Expressed Genes)。(2)GO分析发现,差异表达基因主要富集在单一生物体过程、对刺激反应、碳水化合物代谢、生物调节和对激素响应等过程。(3)KEGG分析表明,糖酵解/糖异生、碳代谢、植物激素信号转导和苯丙烷生物合成等途径在病原菌侵染后发生显著变化。(4)杨树糖转运蛋白SWEETs家族中21个成员的表达受腐皮镰刀菌侵染诱导。乙烯受体ETR、乙烯信号通路主要基因EIN3、ERF1、ERF2上调表达,木质素合成关键酶基因CCR、4CL、C3’H、COMT表达量显著升高。[结论]杨树可能通过调节体内糖代谢和转运,激活乙烯信号通路,促进木质素积累、细胞壁增厚等策略,响应腐皮镰刀菌的侵染。

黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法建立

本研究成功建立了一种针对黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。该方法基于腐皮镰刀菌翻译延伸因子EF-1α基因序列,设计了特异性引物对FP.F/FP.R,并验证其特异性。建立腐皮镰刀菌的RT-qPCR检测方法;运用所建方法检测黄芪及土壤中腐皮镰刀菌的含量,验证其检测效果。结果表明:设计的引物FP.F/FP.R特异性强,RT-qPCR检测的灵敏度为0.0192 ng/μL,重复性评价显示方法稳定、可靠。应用该RT-qPCR方法,可从黄芪接种发病和疑似发病样本及土壤样本中检测出腐皮镰刀菌。结果表明,3组样本的总阳性检出率均为100%。同时,植株和土壤中腐皮镰刀菌的含量变化与根腐病的严重度基本一致。因此,本研究建立的RT-qPCR方法能够有效地用于黄芪植株及土壤中腐皮镰刀菌的定量检测,为根腐病的早期诊断、预警和病原菌的动态监测提供了重要的技术支持。

台湾泥鳅腐皮病霍乱弧菌的分离与鉴定

为研究台湾泥鳅(Paramisgumus dabryanus ssp.)腐皮病的病原,对其腐皮等病变部位进行细菌分离纯化,获得1株优势菌株,命名为P1,利用革兰氏染色观察其形态特征,利用PCR扩增技术、16S rRNA基因测序,得到病原菌的序列,用MEGA软件构建系统进化树,再结合生理生化分析结果鉴定菌种名称。结果发现:革兰氏染色阴性,弧形,两端钝圆;菌体长1~1.5μm,宽度1~1.2μm,有菌丝和鞭毛,16S rRNA基因1 395 bp。建立系统进化树后发现,P1与霍乱弧菌处于同一分支;生理生化实验结果与霍乱弧菌一致,从而鉴定该菌株为霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。药敏实验结果表明,该分离菌株对头孢哌酮、卡那霉菌、万古霉素等10种抗生素高度敏感;对四环素中度敏感;对呋喃唑酮、复方新诺明、克林霉素等17种抗生素耐药。实验结果为台湾泥鳅腐皮病的病原鉴定与药物防治提供参考。

腐皮镰刀菌根腐病对砧用南瓜根系形态特征及生理指标的影响

根腐病严重影响瓜类生产,通过比较苗期接种腐皮镰刀菌后抗病和高感砧用南瓜材料根系形态及生理响应,为解析根系响应机理及创制抗根腐病材料提供理论基础。抗病和高感自交系两叶一心时伤根接种法接种,0 d、2 d、4 d、6 d、8 d检测根系总根长、根表面积、平均根系直径、总根体积等形态学指标;同一时期测定根部过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性及丙二醛(MDA)含量。结果表明,在接菌0~8 d,抗病材料总根体积极显著高于高感材料,总根长和根表面积极显著或显著高于高感材料,根构型参数较好。同一时期抗病材料根部的CAT、POD、PAL活性(除0 d)显著高于高感材料,而MDA含量显著低于高感材料。根系吸收功能评价及过氧化物酶系统调节酶的测定可以作为早期抗根腐病砧用南瓜材料的评价指标。

一天死亡近3000斤,牛蛙腐皮、脑膜炎、肠胃炎并发,怎么应对?

近段时间,由于牛蛙市场行情处于低迷阶段,很多养殖场出于成本控制的原因,投料缩减,管理也随之散漫,加上天气不稳定,导致很多的牛蛙养殖场爆发疾病,损失惨重。笔者接到湖南一养殖户求助电话,赶往一线实地调研,了解到该养殖场多次用药以后没有明显效果,一天死亡3,000斤左右,而且呈明显的上升趋势,病情较急.

养殖刺参保苗期重大疾病“腐皮综合征”病原及其感染源分析

2003~2005年冬、春季,山东省和辽宁省众多养殖区域的保苗期刺参(Apostichopus japonicus)暴发了较为严重的传染性疾病—“腐皮综合征”。该病波及面广,传染性强,死亡率常高达90%以上。发病症状主要表现为:厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡。本研究对症状较为典型的3家海参保苗期的发病幼参进行了详细的病原学分析,从所有病参的病灶组织分离得到了1种占有绝对优势的菌株,经人工感染实验证明它对健康刺参具有较强的致病性,且感染病参的症状与自然发病海参的症状相同。通过形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学方法对该菌进行的分类鉴定表明,导致保苗期刺参“腐皮综合征”的致病菌是假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)。同时也对3家养殖场刺参保苗养殖系统进行了分析研究。结果表明,水源中细菌含量不高,为(0.8×102)^(1.2×102)cells/mL,其特征与病灶处优势菌不同;而饵料中细菌含量最高可达3.2×106cells/mL。饵料、池水和池底污物的优势菌与病灶处优势菌基本一致,说明饵料可能是病原菌的主要来源。本研究首次揭示了“腐皮综合征”导致保苗期刺参大规模死亡的原因及其致病原,对刺参健康养殖和病害防治具有重要的指导意义。[中国水产科学,2006,13(4):610-616]

中国大鲵腐皮病病原菌的分离与鉴定

目的报告中国大鲵(Andrias davidianus)腐皮病的主要病原菌的检测及其生物学特征。方法对发病濒死的大鲵病变组织进行细菌学检查及分离,对分离菌进行形态特征、理化特性16S rDNA序列的分子鉴定,并构建系统发育树;进行人工感染试验及药敏试验。结果分离到1株优势菌,根据此株分离菌的形态特征及理化特性,结合16S rDNA序列测定与系统发育分析结果,判定其为气单胞菌属的维氏气单胞菌。此菌对供试健康大鲵、斑点叉尾鮰和小白鼠有较强的致病作用,对供试27种抗菌药物中的头孢美唑等6种高度敏感,对阿奇霉素和新霉素2种中度敏感,对氟哌酸等19种药物耐药。结论所检出的维氏气单胞菌为导致中国大鲵腐皮病的病原菌。

养殖刺参腐皮综合征病原菌的分离与鉴定

2003年春季,山东省青岛地区刺参养殖场暴发了较为严重的传染性疾病-“腐皮综合征”,该病引起的死亡造成约30%的损失。养殖刺参的发病症状表现为:厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡。从患病个体溃疡部位分离得到一种优势细菌KL1,KL1经人工回接感染实验证明对健康刺参具有较强的致病性,且感染病参的症状与自然发病海参的症状相同。通过形态学、生理生化和16SrDNA分子生物学方法对该菌进行的分类鉴定表明,导致养成刺参“腐皮综合征”的致病菌是灿烂弧菌(Vibriosplendidus)。本文首次揭示了该地区“腐皮综合征”导致养成刺参大规模死亡的致病原因,对刺参病害防治和健康养殖具有重要的指导意义。

中草药对刺参腐皮综合征病原菌的体外抑菌试验

用改良二倍稀释法和抑菌圈法测定了24种单方中草药和9种复方中草药对刺参腐皮综合征4种重要病原菌灿烂弧菌、假交替单胞菌、哈维氏弧菌和恶臭假单胞菌的体外抑菌活性。结果显示,不同中草药对特定病原菌抑菌效果差异较大,单方中草药最低抑菌浓度(MIC)为1.56mg/ml,中草药水煎剂H-5和H-9对假交替单胞菌的抑菌圈最大,达22mm。单方中草药中穿心莲、大青叶、金银花和川芎4种中草药对4株病原菌抑菌效果最好,其水煎剂对4株病原菌平均抑菌浓度分别为6.25、7.81、5.86和3.52mg/ml;平均抑菌圈直径分别是17.5、11.3、14.0和11.5mm。将筛选的4种单方中草药组成9种复方,复方MIC和抑菌圈均显著好于单方,最低MIC降低到0.20mg/ml。其中复方HC-G和HC-D抑菌浓度最低,效果最好,平均抑菌浓度分别降低为0.54和0.64mg/ml;平均抑菌圈直径分别为15.3mm和16.3mm。试验结果显示,复方最佳配比为穿心莲、大青叶、金银花和川芎=2∶1∶3∶2。该复方可为生产高效专用中草药,以替代抗生素,为刺参健康养殖提供技术保障。

应用PCR方法检测刺参腐皮综合征病原--灿烂弧菌

腐皮综合征是近年来刺参养殖最主要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。根据其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)的16S^23S间隔区序列,设计特异性引物,利用PCR技术,从纯化的V.splendidus DNA中成功地扩增出产物大小为177bp的DNA片断,并对此方法的灵敏度和特异性进行了研究。结果表明,PCR技术对V.splendidus DNA的检测灵敏度为0.5pg,并且对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而与其他细菌V.fluvialis、V.anguillarum、V.alginolyticus、Aeromonas hydrophila、V.harveyi、V.parahaemolyticus、V.vulnificus的DNA均无交叉反应。应用PCR技术对人工感染的以及取自青岛、烟台和威海的腐皮综合征发病海参进行检测,其检出率均为100%。研究结果表明,PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参腐皮综合征原灿烂弧菌。在国内,该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断及防治提供又一新的方法。

养殖刺参腐皮综合征两种致病菌Dot-ELISA快速检测

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征两种主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清,建立了两种病原菌的点酶ELISA(Dot-ELISA)检测方法。根据方正试验,确定检测用一抗、二抗最佳工作稀释度:灿烂弧菌抗血清稀释度320,酶标二抗稀释度3 000;假交替单胞菌抗血清稀释度160,酶标二抗稀释度2 000。阻断试验结果表明两种抗血清特异性均较高。灿烂弧菌抗血清在稀释度为40时与溶藻胶弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等弧菌发生微弱交叉反应,提高稀释度到160时,不发生交叉反应。假交替单胞菌抗血清基本不与常见海水致病弧菌发生交叉反应。人工感染试验检测结果表明该方法能从患病海参溃烂组织、未发病海参组织和感染水体检测到相应致病菌,检测灵敏度为9.4×103个/mL。人工感染试验检测结果经直接凝集反应验证。该方法操作简便、灵敏度高,不需复杂仪器设备,适合在基层推广。

美国红鱼“腐皮病”病原的初步研究

从有典型'腐皮病'症状的美国红鱼 (Sciaenops ocellatus)中分离到一株优势菌.人工感染菌液浓度为 10 8 CFU/mL时,可致健康美国红鱼出现与自然发病相似的症状,且 100%死亡,确认该分离菌为美国红鱼'腐皮病'的致病菌.该菌的主要生理生化特征为革兰氏染色阴性, 0/129(150 μ g)敏感, TCBS上生长呈黄色,氧化酶阳性,伏-普二试验阴性,葡萄糖产酸不产气,蔗糖发酵阳性,甘露糖发酵阳性,阿拉伯糖发酵阳性,肌醇阴性,赖氨酸阴性,精氨酸阳性,鸟氨酸阴性,硝酸盐还原阳性,七叶灵水解阴性, ONPG阳性,有动力,在盐度 0～ 60生长, 80和 100不生长, 30～ 40 ℃生长, 4 ℃、45 ℃不生长,鉴定该菌为河流弧菌( Vibrio fluvialis).药敏试验表明,该菌对多粘菌素 B、四环素、痢特灵敏感;对卡那霉素、链霉素、复方新诺明、呋喃妥咽、庆大霉素、菌必治不敏感;对氯霉素、青霉素、氨苄青霉素、氟哌酸、环丙沙星、利福平中度敏感.

刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌检测探针的制备及应用

腐皮综合征是近年来养殖刺参发生的严重疾病。发病时,刺参大批死亡,经济损失惨重。以其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)DNA为模板,PCR扩增出16S-23S核糖体RNA基因间隔区序列,插入pMD19-T,转化大肠杆菌DH5α并测序。根据该间隔区序列,设计引物扩增177 bp的地高辛标记的探针。该探针对灿烂弧菌呈现特异性,而对其它细菌V.fluvialis,V.anguillarum,V.alginolyticus,Aeromonas hydrophila,V.harveyi,V.parahaemolyticus,V.vulnificus均呈阴性。探针对灿烂弧菌DNA的检出限为6.25 pg,具有较高敏感度。用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交,灿烂弧菌检出率达100%。结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可用于快速检测养殖刺参腐皮综合征的病原灿烂弧菌。用该方法检测刺参腐皮综合征尚属首次,为刺参腐皮综合征的快速诊断和防治提供技术支撑。

日本鳗鲡腐皮病病原菌的分离及鉴定

从患腐皮病的日本鳗鲡（Anguilla japonica）体表溃烂处分离到1株病原菌（322A）,对其进行了人工感染实验和生理生化分析,测定了该菌株的16S rRNA基因序列和促旋酶（gyrase）B亚单位gyrB基因序列,并分别构建系统发育树。结果显示：感染实验证实菌株322A具有致病性;生理生化分析鉴定该菌株属于气单胞菌属（Aero-monassp.）;16S rRNA基因分析显示,该菌株与气单胞菌属细菌的同源性均在99%-100%,构建的系统树显示,菌株322A与嗜水气单胞菌（A.hydrophila（FJ462702））亲缘关系最近;gyrB基因分析表明,该菌株与A.hydrophila种内序列的相似性为96%-98%,种间序列的相似性为94%-95%,构建的系统树结果显示,该菌株与A.hydrophila（FJ608553、FJ608552、AF208259）聚为一个分支。综合上述实验结果,菌株322A可鉴定为嗜水气单胞菌（A.hydrophila）。

中华鳖“腐皮、疖疮”并发症致病菌的病原分离与药敏试验分析

为了鉴定中华鳖"腐皮、疖疮"并发症的病原菌种类,对已呈明显发病症状且频死的20个、体重在100～1 000 g之间的中华鳖病样进行了病原菌的分离鉴定,经细菌组织涂片、分离培养与纯化、生理生化特性鉴定和人工感染试验证实,主要致病菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和洛菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffi).药敏试验结果表明,两种病原菌对很多抗生素均存在不同程度的耐药性,而对美洛培南(Meropenem)、复方新诺明(Trimethoprim/Sulfa)等高度敏感,可作为防治该病的首选药物.

罗非鱼腐皮病病原菌分离鉴定及其对中草药敏感性试验

为了研究罗非鱼腐皮病的防治方法,通过形态学观察、生化特性等鉴定方法,从患腐皮病的罗非鱼体内分离到1株温和气单胞菌,并进行致病性试验和中草药药敏试验。致病性试验结果显示,分离细菌对罗非鱼有较强的致病作用。中草药药敏试验结果显示:五倍子、乌梅、沙棘、苏木4种单味中草药对分离细菌有较强的抑菌作用,石榴皮次之,陈皮、石菖蒲、鱼腥草、马齿苋、穿心莲、桉树叶、薄荷等无抑菌作用,且五倍子+乌梅的组方抑菌效果最强。

养殖刺参腐皮综合征2种致病菌间接荧光抗体快速检测方法

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征的2种致病菌:灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清。以载玻片为介质,建立了2种病原菌的间接荧光抗体检测技术(IFAT)。交叉反应、阻断试验和吸收试验结果均表明本方法特异性强。对人工感染实验中的养殖水体及发病刺参溃烂组织检测,可以检出水体和患病刺参溃烂组织中的相应病原菌,病原菌被染成明亮的黄绿色,检测灵敏度2.4×104cell/mL。冰冻切片检测结果显示,在刺参肿胀嘴部与溃烂肌肉处有大量染成黄绿色的细菌颗粒。结果表明:采用IFAT可以对刺参腐皮综合征2种致病菌进行准确快速的检测。该方法的建立对刺参腐皮综合征的流行病学调查及快速诊断具有重要意义。

牛蛙腐皮病致病细菌的初步研究

对牛蛙腐皮病的致病菌进行了分离、鉴定和人工感染。从病蛙上分离到5株细菌，通过对健康牛蛙人工感染试验，得知奇异变形杆菌（Proteusmirabilis）和克氏耶尔森菌（Yeriniakristensenii）具有较强致病力，而其他三株菌无致病力。

牛蛙腐皮-红腿病并发症致病菌研究 Ⅰ.嗜水气单胞菌的致病力和生物学特性

从患腐皮－红腿病并发症病蛙腐烂处深层及肝脏分离出两株致病菌，经鉴定为奇异变形杆菌（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）和嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）．人工感染试验结果显示奇异变形杆菌致发牛蛙腐皮病，嗜水气单胞菌致发牛蛙红腿病，且是通过伤口感染．初步认为牛蛙因奇异变形杆菌和嗜水气单胞菌合并感染而致发腐皮－红腿病并发症．