烟叶烟碱含量与腐胺N-甲基转移酶基因表达间的相关性

为探明烟碱合成与积累机制,采用大田试验方法,测定云烟87和红花大金元在四川省6个产区烤后烟叶的烟碱含量,检测其在旺长期、现蕾期及成熟期PMT基因的表达量,并分析PMT基因表达量与烟碱含量之间的相关性。结果表明:四川不同产区不同烤烟品种的烟碱含量差异较大,云烟87和红花大金元在古蔺烟区烟碱含量最高,分别为3.40%和4.37%;云烟87在米易烟区烟碱含量最低,为1.27%,红花大金元在会理烟区烟碱含量最低,为1.36%。经相关性分析,2个品种的烟碱含量均与成熟期PMT基因表达量呈极显著正相关,与现蕾期基因表达量呈显著(红花大金元)或极显著(云烟87)正相关。PMT基因表达量是影响烟碱含量的决定因素之一。

合成茶树咖啡碱相关的N-甲基转移酶基因家族的克隆及序列分析

咖啡碱是茶叶中重要的功能成分,它以黄苷为底物,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,通过N-甲基转移酶(NMT)类催化的一系列甲基化反应合成的产物。根据NMT基因高度相似的特性,利用长片段PCR法和侧翼序列克隆技术分离了白叶一号6种NMTs的基因组DNA全长,其中有2种为已报道的茶树咖啡碱合成酶基因TCS1、TCS2,1种为假基因,另3种基因分别被命名为TCS3、TCS4、TCS5,基因结构分析发现这6种基因均由4个外显子和3个内含子组成。山茶属植物的NMTs可聚为5类,其中TCS4和TCS5为与其他基因的相似性相对较低的一类。这些结果为今后更好地从基因组水平上剖析茶树咖啡碱的遗传机制提供有用参考。

天然无咖啡碱茶叶N-甲基转移酶基因克隆与序列分析

本研究以天然无咖啡碱南昆山毛叶茶为主要研究材料,以不同咖啡碱含量的英红9号茶树品种和红山茶等山茶属植物为对照,采用RT-PCR技术,克隆获得南昆山毛叶茶、英红9号和福云6号茶树品种的NMT基因全长,分别编码365、369和369个氨基酸。序列比较分析表明南昆山毛叶茶NMT基因与其它茶树NMT基因的核苷酸序列同源性高于86.5%,氨基酸序列同源性高于86.3%,并包含了六个保守序列、三个SAM结合区A、B’、C及一个保守域VFFF。基于同源性比较,推测核苷酸序列的差异可能是导致南昆山毛叶茶NMT基因活性改变、影响茶树体内咖啡碱代谢的原因之一。

磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶基因G175A多态性与非酒精性脂肪肝的关系

目的研究磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶(PEMT)基因外显子8的G175A多态性与非酒精性脂肪肝(NAFLD)的关系。方法采用聚合酶链反应限制性片段长度多态法检测并比较51例NAFLD患者和50名健康对照者PEMT基因外显子8的G175A基因型、等位基因频率,分析不同基因型对各临床指标的影响。结果NAFLD组和正常对照组PEMT基因175位点的基因多态性分布差异有显著性(GG、GA、AA在两组中的比例分别是58.8%、78.0%和39.2%、22.0%和2.0%、0.0%,χ2=4.289,P=0.038),NAFLD组A等位基因频率高于对照组(21.6%比11.0%,χ2=4.127,P=0.042),NAFLD患者中G175A突变型的高密度脂蛋白水平低于野生型患者(2.88±1.02 vs 2.04±0.96,P<0.05),而低密度脂蛋白水平明显高于野生型(3.22±0.88 vs 3.87±0.35,P<0.01),Logistic回归分析显示基因位点pemtG175A突变型、低密度脂蛋白是脂肪肝形成的主要危险因素(P<0.05)。结论PEMT基因外显子8的G175A多态性与NAFLD发病易感性相关。

茶树N-甲基转移酶基因启动子克隆及功能分析

咖啡碱是茶叶中重要的功能物质,N-甲基转移酶(NMT)是其生物合成的关键酶。本研究以英红9号茶树新梢为材料,利用hiTAIL-PCR克隆NMT1基因启动子,并采用PlantCARE等在线软件分析其顺式作用元件。根据其元件组成,设计5'递减的启动子与GUS基因一起组建了融合载体转入烟草,利用GUS染色和定量PCR方法,分析了克隆的启动子功能及其对环境因子的响应。结果表明,克隆的NMT1基因启动子长767 bp,含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子基本元件及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。以5'递减的NMT1启动子替换pBI121中的CaMV35S启动子,构建出与GUS融合的pA、pB、pC、pD载体。在烟草叶片中进行瞬时表达,不同长度的NMT1启动子均具驱动GUS表达功能,且长度越长驱动能力越强。以含全长NMT1启动子载体pA对烟草转基因,转基因烟草各组织均检测到GUS基因的表达且表达量叶>茎>根,叶片中的表达量为根部的3倍。对转基因烟草进行不同程度光照、温度、模拟干旱和脱落酸处理后,除40℃温度条件外,其他处理的叶片中GUS基因表达在处理前后均存在显著变化,表明NMT1启动子功能受外界环境因子的胁迫影响。

螺旋霉素生物合成基因簇中N,N-二甲基转移酶基因功能的鉴定

目的 确定螺旋霉素(SP)生物合成途径中编码两个N, N-二甲基转移酶的基因bsm9和bsm22的功能,并在基因阻断变株中分离纯化相应的SP前体物。方法 利用抗性基因插入或CRISPR-Cas基因编辑的方法阻断bsm9和bsm22基因,并对其进行基因回复实验。利用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用分析变株Δbsm9和Δbsm22的发酵产物。利用半制备液相色谱的方法分离纯化缺少甲基化修饰的SP前体物,经核磁共振波谱(NMR)数据分析确定其化学结构。结果 成功构建了两个基因的阻断株Δbsm9和Δbsm22。Δbsm9变株的发酵液没有抗菌活性的物质产生,经HPLC-MS分析也未发现相应的SP前体物。而Δbsm22变株的发酵产物的抗菌活性下降50%以上,从Δbsm22变株发酵产物中分离出福洛胺糖缺少两个甲基的SP前体物。结论 bsm22基因负责SP生物合成中福洛胺糖上的N, N-二甲基的催化,而bsm9基因可能参与麦洛胺糖的N, N-二甲基化修饰,且两者在功能上不能互补。

烟草打顶对腐胺N-甲基转移酶基因表达的影响

水培65d的烟株进行打顶后,测定打顶和不打顶烟株上部叶中烟碱含量。分别提取根中总RNA,以腐胺N-甲基转移酶基因(PMT)特异引物、肌动蛋白基因(actin)为内参作半定量RT-PCR分析;同时将提取的总RNA转膜,用地高辛标记PMTRT-PCR产物作探针,进行Northern杂交分析的结果表明,打顶后的上部烟叶中烟碱含量和PMT基因表达量显著增加。

枸杞胆碱合成关键酶基因PEAMT的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR和RACE结合的方法,获得了枸杞磷酸乙醇胺N-甲基转移酶PEAMT基因cDNA全序列(命名为LbPEAMT)。LbPEAMTcDNA全长1 863bp,开放读码框1 497bp,编码一个由498个氨基酸构成的多肽,理论分子量为56.53kDa,等电点pI为5.50。通过多种序列比对,该基因编码的氨基酸序列与番茄PEAMT氨基酸的相似性为93%。二级结构预测LbPEAMT蛋白由44.98%的α-螺旋、17.67%的延伸链、6.63%的β-转角和30.72%的不规则卷曲组成。LbPEAMT是一个亲水蛋白。含有2个S-腺苷甲硫氨酸依赖催化活性结构域,分别位于N端65-164aa和C端290-392aa。每个活性区都包含有4个部分基序,分别为I、post I、post II和post III。LbPEAMT的这2个活性区在蛋白、磷脂和小分子甲基转移酶中都是相对保守的。

植物甜菜碱合成相关酶及其基因工程研究进展

甜菜碱(Glybet)是植物体中起着无毒渗透保护作用的最主要的细胞相溶性物质,许多高等植物在干旱、盐碱和低温等不利环境下,在细胞中会积累大量甜菜碱,以维持细胞的正常膨压。综述了植物甜菜碱合成途径中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶、胆碱单加氧酶和甜菜碱醛脱氢酶的分子生物学特性及其基因工程研究的最新进展。

烤烟根系激素水平、GS、PMT对氮素形态的响应

通过水培试验,探讨了不同氮素形态对烤烟苗期根系激素水平与氮代谢酶的影响。研究结果表明,外源铵态氮对烤烟根系及叶片的谷氨酰胺合成酶(GS)具有一定的诱导作用,饼肥浸提液对烤烟叶片GS有激活作用、对根系GS有抑制作用;外源铵态氮对根系烟碱合成关键酶N-甲基腐胺转移酶(PMT)活性有激活作用;不同氮素形态对根系激素的影响不同,纯铵态氮处理的IAA含量最高,纯硝态氮处理的ABA含量最高,铵态氮与硝态氮1∶1处理的ZR含量最高,浸提液对IAA,ABA,ZR,IAA/ABA,ZR/ABA有明显的激活作用。

组胺基因组学研究进展

组胺是机体重要的自体活性物质之一,经其各型受体介导参与多种生理病理过程。随着人类基因组计划及国际人类单体型图项目的完成,组胺相关基因多态性与疾病的关联性研究日渐成为国内外学者研究热点。本文就目前国内外关于组胺相关基因多态性研究现状进行了综述,以期为后续研究组胺相关基因与疾病的关联性提供较为系统的文献基础。

茶树CsASMT基因的克隆和表达分析

该研究在茶树转录组测序的基础上,以茶树品种‘舒茶早’为试验材料,采用SMARTTM RACE技术,克隆了茶树褪黑素合成途径中关键限速酶N-乙酰基-5-羟色胺甲基转移酶基因(CsASMT)的cDNA全长序列。CsASMT基因序列全长1 282bp,其中包含1 065bp完整开放阅读框(ORF),编码354个氨基酸,预测等电点5.37,蛋白分子量38.98kD。系统进化分析表明,CsASMT与珠美海棠(Malus zumi)ASMT9的亲缘关系最近。将目的基因分别与pET-32a(+)和pMal-c2X载体重组,然后再转化入原核表达菌株BL21(DE3)中,pET-32a(+)/CsASMT在28℃用0.5mg/mL IPTG诱导6h后,以包涵体蛋白的形式表达,而pMal-c2X/CsASMT经诱导后在上清中可获得分子量为79kD大量可溶性融合蛋白。实时定量PCR分析表明,茶尺蠖取食抑制CsASMT基因表达;褪黑素、ABA、MeJA和SA均能够诱导CsASMT基因显著上调表达。该研究结果为N-乙酰基-5-羟色胺甲基转移酶功能研究奠定了一定的基础。

钾营养调控烟草烟碱生物合成关键基因研究

为明确钾营养供应对烟碱生物合成的影响规律,采用定量PCR和气相色谱-质谱联用法,研究不同供钾量条件下,烟草叶片烟碱含量和根系腐胺N-甲基转移酶(PMT)与喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)的表达情况。结果表明,低钾供应会增加烟叶的烟碱含量、促进根系PMT基因的表达;高钾供应对烟叶的烟碱合成和根系的PMT基因表达具有明显的抑制效应。低钾处理后再恢复正常钾供应水平,可显著降低由低钾供应对烟碱合成和PMT基因表达的促进作用。不同的供钾水平同样影响QPT基因的表达水平,但与烟碱积累量的变化不存在明显的相关性。因此,烟草植株的烟碱含量受供钾水平的影响,钾可能通过控制根系腐胺N-甲基转移酶基因的表达来影响烟叶中烟碱的积累。

过表达内源PMT和H6H基因对颠茄发根托品烷类生物碱合成的影响

颠茄是我国药典规定的托品烷类生物碱包括东莨菪碱和莨菪碱最主要的商业栽培的药源植物。本研究采用基于发根的基因表达系统,农杆菌介导遗传转化颠茄,潮霉素筛选获得转颠茄自身PMT和H6H基因发根;基因组PCR鉴定转基因发根;液体摇床培养后,HPLC测量莨菪碱和东莨菪碱含量;qPCR检测颠茄PMT和H6H基因表达水平。基因组PCR检测获得5个双基因共转化颠茄发根系,其中2个发根系(PH2和PH14)的总生物碱含量得到显著提高,最高的PH2总生物碱含量为非转基因发根的2.7倍;另外3个转基因发根系总生物碱含量与对照相比没有显著性差异。4个转基因发根系(PH2、PH32、PH14和PH20)东莨菪含量都有提高,其中PH2东莨菪碱含量比对照提高了8.2倍。基因表达量与生物碱含量结果基本一致,说明颠茄发根中PMT和H6H两者同时维持高水平表达可以极大程度的促进东莨菪碱积累。

评价替莫唑胺对脑胶质瘤治疗敏感性的新方法

背景与目的:替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是治疗胶质母细胞瘤的唯一化疗药。O^6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)基因启动子甲基化是评价TMZ敏感性的唯一指标。但通过检测MGMT的甲基化程度来评估TMZ的敏感性是不够的,因为目前MGMT检测只是定性检测,而且这种检测只能反映DNA损伤修复的一条通路,而另两条通路的修复情况却没有反映出来。方法:该研究一方面是应用高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM),对MGMT的甲基化进行定量检测,同时应用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQPCR)来探讨另外两条修复通路蛋白N-甲基化嘌呤DNA糖基化酶(N-methylpurine DNA glycosylase,MPG)和人类烷烃羟化酶基因同系物2(alkane hydroxylase gene homolog 2,ALKBH2)的mRNA表达。将MPG和ALKBH2的表达分为高表达和低表达。结果:结合MGMT的甲基化(阳性)和非甲基化(阴性)程度,再把MPG和ALKBH2结合起来评估患者对TMZ的敏感性。三阳性(MGMT非甲基化,MPG阳性和ALKBH2阳性)为化疗抵抗,两阳性为不敏感,两阴性为次敏感,三阴性(MGMT甲基化,MPG阴性和ALKBH2阴性)为最敏感。结合8例胶质母细胞瘤患者的检测和生存期,结果与我们的判断结果相吻合,三阴性的患者生存时间最长,三阳性的患者的生存时间最短。结论:通过定量检测MGMT同时结合MPG和ALKBH2可以更精准地判断TMZ的敏感性。

利用半定量RT-PCR检测烟碱生物合成的方法

将水培65 d的烟株进行打顶处理,测定打顶和不打顶烟株上部叶的烟碱含量。分别提取根中总RNA,利用腐胺-N-甲基转移酶(PMT)基因特异引物进行actin做内参的半定量RT-PCR,分析打顶前后PMT转录水平。结果表明,上部烟叶烟碱含量和腐胺-N-甲基转移酶基因表达量的变化趋势是一致的。

植物中的咖啡碱：从合成途径研究到转基因作物

在植物细胞中咖啡碱的核心合成途径为：黄嘌呤核苷→7-甲基黄嘌呤核苷→7-甲基黄嘌呤→可可碱→咖啡碱，即3次顺序甲基化反应和1次核糖水解过程。目前已经从茶树等植物中分离出催化上述甲基化反应的酶，并克隆得到编码这些酶的基因。在此基础上，利用RNAi干扰和农杆菌介导法等技术，已成功培育出低咖啡碱饮料作物茶树和咖啡以及能合成咖啡碱的烟草和菊花植株。

人类DOT1L基因在地西他滨抑制人单核细胞白血病细胞株THP-1增殖中的作用 及机制研究

目的 分析人类DOT1L（hDOT1L）信号途径在地西他滨抑制人单核细胞白血病细胞株THP-1细胞增殖中的作用,探讨其DNA去甲基化以外的可能作用及hDOT1L信号途径参与白血病发生的机制.方法 四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同浓度地西他滨对THP-1细胞增殖的影响,锥虫蓝拒染法检测地西他滨对THP-1细胞存活率的影响,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测hDOT1L、HOXA9、HOXA10、MLL-AF10（MLLT10）mRNA表达水平,蛋白印迹法检测甲基化H3K79蛋白水平.结果 与阴性对照组相比,各浓度地西他滨明显抑制THP-1细胞增殖,72 h抑制作用最明显,最高抑制率达56.18%,呈时间和浓度依赖性.与阴性对照组相比,除0.5μmol/L地西他滨处理组外,其余各浓度地西他滨对THP-1细胞抑制率差异均有统计学意义（均P〈0.05）.THP-1细胞内hDOT1L及HOXA9、HOXA10、MLLT10 mRNA水平高H3K79过甲基化,各浓度地西他滨处理48 h后均可降低细胞内hDOT1L mRNA水平,并下调细胞内HOXA9、HOXA10、MLLT10 mRNA水平,与阴性对照组比较差异均有统计学意义（均P〈0.01）.各浓度地西他滨处理48 h后细胞内H3K79甲基化水平明显降低,以双甲基化和三甲基化H3K79蛋白表达水平下降最明显,与阴性对照组比较差异均有统计学意义（均P〈0.01）.结论 地西他滨可能通过某种机制减少hDOT1L表达水平,降低H3K79甲基化水平,并可能抑制其信号途径中的关键分子HOXA9、HOXA10、MLLT10的表达,发挥其抑制THP-1细胞增殖的作用.