重组腐败梭菌α毒素对兔的免疫效力分析

本研究旨在获得重组腐败梭菌α毒素,并评价其毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,通过人工合成获得基因片段Gcsa。将Gcsa克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,从而获得重组蛋白rCSA。利用Western blot方法检测纯化的rCSA与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用犬肾细胞系(MDCK)和小鼠来检测rCSA的毒力。以甲醛脱毒后的rCSA与Montanide ISA 201佐剂以1∶1的比例制备疫苗,免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,rCSA为可溶性表达,比例可达50%,且能与腐败梭菌抗血清反应。MDCK细胞毒性试验显示,0.15ng·mL^(-1)的rCSA即可引起明显的细胞病变;小鼠安全性试验显示,rCSA对ICR小鼠的最小致死量是1.5×10~6 ng·kg^(-1);每毫升的一免抗血清可中和100~130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免抗血清可中和360~480个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了4/4的保护。以上结果表明,rCSA具有良好的免疫原性,可作为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的候选抗原。

含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因的重组大肠杆菌的高密度发酵和免疫效果

为确定含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的生产效率并评价其作为抗原的免疫效果,用生物反应器对重组大肠杆菌DE3-pET-AE进行高密度发酵,并将其制苗后以不同抗原剂量分别接种家兔和绵羊,间隔21d进行二免,分别测定一免、二免动物混合血清的中和效价。发酵结果显示,培养物菌体密度D600nm达20.3,相对表达量为27.6%,D600nm与相对表达量的乘积为摇瓶培养的6.5倍,菌体湿质量为37.2g/L;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,目的蛋白以可溶形式表达。动物免疫效果评价结果显示,在家兔和绵羊上,抗原含量与免疫效果在一定的范围内均呈正相关,当接种量为300μg/只时,免疫效果均最好;对腐败梭菌毒素与D型产气荚膜梭菌毒素的血清中和效价,在家兔上一免、二免分别达4与30、15与200,在绵羊上一免、二免分别达2与30、12与250。结果表明,DE3-pET-AE菌高密度发酵可获得高产量蛋白抗原,且抗原的免疫效果明显优于《中华人民共和国兽药典》合格标准。

C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌二价二联类毒素疫苗的创制及其效果评价

羊肠毒血症、羊快疫发病急死亡快,一般采用免疫接种疫苗的方式才可以有效防控。本研究将C型产气荚膜梭菌的外毒素、D型产气荚膜梭菌外毒素和重组腐败梭菌α毒素按一定比例混合,经甲醛灭活乳化后制成二价二联类毒素疫苗。参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》分别对疫苗进行了安全性检验、无菌检验和免疫效力检验等。6~7月龄的绵羊接种本疫苗21 d后,通过间接ELISA和毒素中和试验检测绵羊血清中抗体效价。免疫效果显示,绵羊血清中抗C型产气荚膜梭菌毒素的抗体效价为1:3200,抗D型产气荚膜梭菌毒素的抗体效价为1:6400,抗腐败梭菌毒素的抗体效价为1:6400;而中和效价分别为1:400,1:800和1:800。说明本实验所制备的疫苗效价较高,且安全可靠,能够为绵羊提供可靠的抗感染保护。该二价二联复合类毒素疫苗是国内首创,使疫苗的抗原成分由菌体上升为毒素蛋白,具有鲜明的创新。

腐败梭菌α毒素重组突变体的免疫保护力评价

本研究旨在获得腐败梭菌OL毒素（CSa）的重组突变体，并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌OL毒素编码基因进行优化设计，同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变，经人工合成获得基因片段Gcsam4。将Gcsam4克隆至原核表达载体pET-30（＋）中进行表达与纯化，获得重组蛋白rcsam4。利用Western—blot检测rcsam4与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性，并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后，将rcsam4与Montanide ISA206佐剂以1：1（v／V）的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔，按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素，来检测rCSam4对家兔的免疫保护效果。结果表明。rcsam4主要以包涵体的形式存在，且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示，9．85μg／mL的蛋白仍无细胞毒性：小鼠安全性试验显示，5．5×10^3μg／kg的剂量对小鼠无致死性；免疫rcsam4后，每毫升的一免兔血清可中和50~70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素；每毫升的二免兔血清可中和110～130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素；1个家免MLD的腐败梭菌毒素攻毒后，对照组家兔全部死亡，免疫组家免得到了100％（4／4）的保护。以上结果表明，rcsam4在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。