IBDV感染对SPF鸡腔上囊与外周血单核细胞TLR3／4／15mRNA表达的影响

通过点眼将IBDV感染4周龄SPF鸡,采用相对荧光定量PCR技术检测SPF鸡腔上囊单核细胞(BBMC)和外周血单核细胞(PBMC)在感染后不同阶段TLR3/4/15mRNA表达动态变化,探讨IBDV感染对免疫反应的影响。结果显示,感染后1dBBMC中TLR3、15的mRNA表达水平高于对照组,差异显著(P≤0.05);在感染后5dTLR3、4显著高于对照组(P≤0.05);在感染后15dTLR3/4/15的mRNA表达水平恢复到正常水平。PBMC中,感染后1dTLR3、4mRNA表达水平均显著高于对照组(P≤0.05),TLR15极显著高于对照组(P≤0.01);而在感染后5d和15d,TLR3/4均显著高于对照组(P≤0.05)。以上结果表明,IBDV感染早期上调了腔上囊和外周血单核细胞的TLR3/4/15的mRNA表达水平,增强了机体的固有免疫反应。

近期引起免疫失败的传染性腔上囊病病毒VP2基因的分子特征

用RT-PCR方法从2007年12月在安徽境内发生的两起传染性腔上囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡腔上囊组织样品AH1与AH2中扩增出了传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2基因。序列分析表明,AH1与AH2病毒VP2基因长度均为1 350 nt,编码450 aa,七肽基序均为S-W-S-A-S-G-S,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、QI、、D、AI、和S,具有IBDV强毒的分子特征,AH1和AH2感染的20日龄雏鸡产生明显IBD病变,死亡率为25%(1/4)。同源性分析表明,26个血清Ⅰ型IBDV毒株VP2基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为90.7%～99.6%和95.5%～100%,不同IBDV毒株VP2基因的七肽基序、特征性氨基酸残基以及高变区的亲水性有差异。在进化树上,26个血清Ⅰ型IBDV毒株可分为数组,其中的15个中国分离IBDV毒株不在同组,毒株之间的亲缘关系与分离地区或分离时间没有明显的联系。AH1和AH2与现行商品疫苗毒株B87的VP2基因核苷酸序列的差异率分别为5.3%和5.2%,这也进一步佐证了IBDV野毒VP2基因变异所引起的毒力变化和VP2抗原表位的漂移是导致当前IBD疫苗免疫预防失败的主要原因。

黄芪多糖对鸡新城疫和传染性腔上囊病疫苗免疫力的影响

将黄芪多糖 (APS)分别按 0、2 .5、5 .0、10 .0mg/只 ,以点眼、滴鼻、皮下注射、肌肉注射的不同方式 ,分别与鸡NDⅠ系、NDⅣ系、ND油乳剂苗和IBD冻干苗同时接种于 4组 (每组 35只 )健康非免疫雏鸡 ,对血清中ND、IBD抗体效价及脾、腔上囊重量的变化进行了动态观察。检测结果 :各APS组血清ND、IBD抗体效价显著高于APS空白组 (P <0 .0 5 ) ,其中以APS 5 .0mg/只组的抗体效价最高 ;除ND油乳剂苗各APS组和NDⅣ系APS 2 .5mg/只在 12日龄测定值外 ,各APS组脾和腔上囊重量显著高于APS空白组 (P <0 .0 5 )。试验表明 ,APS可用作鸡疫苗的免疫佐剂提高鸡的免疫力 ;点眼、滴鼻、皮下注射、肌肉注射的接种方式不影响APS提高鸡免疫力的作用 ;APS以 5 .

传染性腔上囊炎疫苗免疫鸡TLR7基因表达的动态变化

给11日龄雏鸡分别口服接种鸡传染性腔上囊炎(IBD)弱毒疫苗(法贝灵,IBD-Blen)1和3头份后,于不同时间采集脾和腔上囊组织,分离纯化淋巴细胞,常规方法抽提总RNA,以鸡β-actin基因为内参,采用半定量RT-PCR法检测两种组织中鸡Toll样受体7(ChTLR7)基因的表达动态。结果显示,接种IBD弱毒疫苗前,试验鸡脾和腔上囊组织中均有ChTLR7的微量表达,疫苗接种后第7 h,脾中ChTLR7 mRNA的表达开始显著上调,至接种后第12 h达峰值,此后迅速下降,至第130 h时降至疫苗接种前的水平;而腔上囊组织中ChTLR7 mRNA的表达自接种后第12 h开始增加,第24 h时达峰值,随后迅速下降,约72 h后恢复至疫苗接种前水平。表明ChTLR7可能参与了IBDV感染早期的天然免疫反应过程。

中药“增免散”对鸡腔上囊细胞凋亡和外周血T细胞亚群的影响

将300只1日龄雏鸡随机分成正常对照组、中药“增免散”组、环磷酰胺组、环磷酰胺组+左旋咪唑组、环磷酰胺+“增免散”组,6日龄用鸡新城疫(ND)La Sota疫苗免疫点眼滴鼻,14、21、28、35日龄测定鸡血液ND抗体效价、外周血液CD4+、CD8+T淋巴细胞浓度、腔上囊器官指数、腔上囊细胞凋亡率,探索中药“增免散”的免疫增强机理。结果表明:中药“增免散”不但能提高外周血液中CD4+/CD8+T淋巴细胞百分比,促进鸡腔上囊的生长发育,降低腔上囊细胞凋亡率,而且对环磷酰胺的免疫抑制有部分拮抗作用。

传染性腔上囊病病毒与禽腺病毒混合感染的分子鉴定

应用设计的分别针对传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2蛋白基因高变区(vVP2)和Ⅰ群禽腺病毒(FAV)六邻体(hexon)蛋白基因的特异性PCR引物,对临床疑似IBD病例的2只鸡的腔上囊样品和泄殖腔拭子样品分别进行IBDV和FAV的分子检测。结果显示,通过巢式PCR从2份腔上囊样品中均扩增出了471 bp的IBDV vVP2特异性目的片段;SspⅠ和SacⅠ的酶切分析以及序列测定分析证实,该目的片段属超强毒IBDV(very virulent IBDV,vvIBDV)的特征性序列,与常用疫苗株的亲缘关系较远。从2份泄殖腔拭子样品中均扩增出了900 bp的FAV特异性目的片段;序列测定和遗传进化分析表明,该片段在分子水平上属于血清1型FAV(FAV-1)。结果表明,该病例同时感染了vvIBDV和FAV-1。

鸡传染性腔上囊病病毒Gt株全基因组序列分析及真核表达载体的构建

采用一步法长距离RT-PCR克隆了IBDV Gt株全基因组,对其核苷酸和氨基酸序列进行了系统分析。在IBDV Gt株全基因组中引入分子标签,且在基因组两端分别引入锤头状核酶结构(HamRz)和丁肝病毒核酶结构(HdvRz)。将带有分子标签和核酶结构的IBDV基因组插入载体pCAGGS的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV真核表达载体pCAGGmGtAHRT和pCAG-GmGtBHRT,为IBDV新型高效拯救平台的构建及基于此的病毒基因功能奠定了基础。

皖西白鹅腔上囊VIP和NPY阳性神经元分布的研究

应用免疫组织化学SABC染色法,对皖西白鹅腔上囊的血管活性肠肽(VIP)和神经肽Y(NPY)定位进行了研究。结果发现免疫阳性神经元在粘膜、粘膜下层,囊小结的皮质、髓质以及血管有表达,提示禽类的腔上囊内有肽能神经分布,并有可能参与禽的免疫器官的功能调节和控制淋巴细胞的迁移。

鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDVVP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDVVP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku。

胚胎及胚后发育期鸭腔上囊淋巴细胞增殖与凋亡的研究

采用PCNA免疫组化法和TUNEL染色法,并结合光、电镜技术研究天府肉鸭胚胎及胚后发育期腔上囊淋巴细胞增殖与凋亡的动态变化规律。结果显示胚胎期腔上囊淋巴细胞增殖明显,其滤泡淋巴细胞增殖指数(PIF)随胚龄增加而逐渐增高,26 d胚龄达峰值。胚后期各组滤泡皮质淋巴细胞增殖指数(PIC)和髓质淋巴细胞增殖指数(PIM)均呈下降趋势;各组PIM均明显高于PIC。胚胎期腔上囊滤泡淋巴细胞凋亡指数(AIF)随胚龄增大而逐渐增高。胚后期0~3周龄滤泡髓质淋巴细胞凋亡指数(AIM)继续增高,滤泡皮质淋巴细胞凋亡指数(AIC)则无明显变化;AIC和AIM在5周龄下降,17周龄明显升高,29周龄达峰值。胚后0~14周龄,各组AIM均明显高于AIC,而17~29周龄AIM则明显低于AIC。凋亡淋巴细胞核呈现多种形态,线粒体肿胀,嵴断裂。结果提示淋巴细胞增殖与凋亡在鸭腔上囊胚胎及胚后发育的整个过程中普遍存在,具有明显增龄变化特性,二者协同参与腔上囊发育和退化过程。

鸡传染性腔上囊病病毒双夹心ELISA检测方法的建立

通过制备兔抗鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)、小鼠抗IBDV和绵羊抗兔免疫血清,并纯化绵羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体,采用方阵滴定法测定其最佳使用浓度,建立了IBDV双夹心ELISA检测方法。结果显示,包被抗体的最适稀释度为1∶160,兔抗IBDV的最佳稀释度为1∶200,酶标记抗体的最佳稀释度为1∶400。特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性强,重复性好,与鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡减蛋综合征病毒抗原均不发生交叉反应。对人工感染病例的检测结果表明,建立的双夹心ELISA方法可用于临床快速诊断IBDV。

中药对鸡传染性腔上囊病和鸡新城疫疫苗的免疫增强作用效果试验

给经ND和IBD疫苗常规免疫的 5 4日龄岭南黄鸡饮服红参、灵芝、黄芪、花旗参等中药制剂 ,10d后测定血清ND和IBD抗体 ,并在 64和 74日龄时称重。结果 :与对照组比较 ,ND和IBD血清抗体和体重均有不同程度的提高。

鸭腔上囊胚胎及胚后发育期凋亡相关蛋白的免疫组化分析

研究天府肉鸭腔上囊胚胎及胚后发育期Bcl-2、Bax、Fas、FasL蛋白的表达。将20只天府肉鸭分为4组,即24天胚龄(E24),胚后3、8、29周龄(P3、P8、P29),采用免疫组化技术。结果显示,Bcl-2、Bax、Fas、FasL在各组滤泡淋巴细胞中均有表达,FasL还表达于滤泡间上皮。滤泡皮质和髓质淋巴细胞Bcl-2阳性率呈递减的变化趋势(髓质P3～8除外);皮质和髓质淋巴细胞Bax阳性率在E24～P8恒定,P29上升;皮质和髓质淋巴细胞Bcl-2/Bax值呈下降趋势,但皮质在P3～8恒定,髓质在P3～8上升;滤泡皮质和髓质淋巴细胞Fas阳性率在E24～P3上升,P3～8下降,P8～29上升;皮质和髓质淋巴细胞FasL阳性率变化规律与Fas相似,但皮质在P3～8恒定。滤泡皮质淋巴细胞Bcl-2阳性率及Bcl-2/Bax值在E24～P8明显高于髓质,在P29则显著低于髓质;皮质淋巴细胞Bax阳性率在E24～P8与髓质无显著差异,在P29则明显高于髓质;皮质淋巴细胞Fas和FasL阳性率在E24～P8明显低于髓质,在P29则显著高于髓质。结果提示,Bcl-2、Bax、Fas、FasL是鸭腔上囊胚胎及胚后发育期淋巴细胞凋亡的重要调节物。

鸡腔上囊提取液对雏鸡免疫功能的影响

为了研究腔上囊提取液对鸡免疫反应的影响，本试验在改进提取工艺的同时，研究了提取液对雏鸡脾、腔上囊等免疫器官重量及对巨噬细胞吞噬功能的影响。结果表明，腔上囊提取液能够提高巨噬细胞的吞噬功能，促进机体的免疫反应，在应用初期对腔上囊重量有一定影响。１材料与...

传染性腔上囊病病毒广西流行株免疫原性的研究

分别制备传染性腔上囊病病毒（IBDV）广西流行毒株040124、BH11、TSC-2（9）和YL052以及参考强毒株CJ801-BKF的灭活油乳剂疫苗（OEV）及其多价OEV,分别进行IBD商品疫苗毒株B87（in）和FW2512对4个广西流行毒株的攻毒免疫保护试验、流行毒株间的免疫交叉保护试验、多价OEV不同免疫剂量及其与CJ801-BKF株OEV的免疫保护对比试验。结果显示,2个IBD商品疫苗均不能对4个流行毒株提供完全的保护;4个流行毒株的OEV对同源毒株的攻毒均可产生100%保护,其中040124株OEV的交叉免疫保护性最好;在毒株免疫组与未免疫组免疫器官指数的比较中发现,TSC-2（9）株OEV免疫鸡的免疫器官受病毒的损伤程度最严重,而040124、BH11和YL052株OEV的免疫均能较好地保护鸡的免疫器官免受病毒的损伤;多价OEV 3个免疫剂量的免疫保护指数（IPI）为80%~100%,1 mL免疫组的IPI显著高于0.25 mL免疫组（P〈0.05）,而1 mL免疫组与0.5 mL免疫组差异不显著（P〉0.05）;多价OEV的免疫效力显著高于毒株YL052、TSC-2（9）和CJ801-BKF的OEV（P〈0.05）。结果表明,本研究制备的多价灭活疫苗适用于本地IBD的防制。

传染性腔上囊病病毒VP2基因表达条件的优化

用摇瓶培养法,对用作生产传染性腔上囊病基因工程亚单位疫苗的基因工程菌种BL21/pET28a-VP2的表达条件进行了优化研究.其结果为:温度37℃,诱导表达时间3～7h,用乳糖诱导时终浓度为20mmol/L时即达到最高表达量;用IPTG诱导时终浓度为0.33mmol/L时即达到最高表达量;乳糖的诱导效果优于IPTG.

CpG ODN对传染性腔上囊病病毒活疫苗免疫效果的影响

将120只来航系SPF鸡随机分成对照组、注射CpG ODN组、IBDV活疫苗点眼免疫组及IBDV活疫苗+CpG ODN免疫组,每组30只,于7日龄时对试验鸡进行初次免疫,21 日龄时进行加强免疫,28日龄时用IBDV野毒株攻毒。检测不同时间的IBDV特异性抗体效价、血液和脾淋巴细胞的Con A刺激指数(SI)。结果表明,CpG ODN处理后脾细胞的增殖转化能力强于血液淋巴细胞的增殖转化能力;CpG ODN的使用使血清中IBDV特异性抗体产生时间提前7 d,抗体效价升高;与对照组相比,仅用CpG ODN处理就可使1/3的鸡攻毒后迅速产生高效价(约1∶3 000)的特异性抗体,降低了发病率和死亡率,证明CpG ODN能增强IBDV活疫苗的免疫效果。

鸡腔上囊传出神经元的分布——用CB—HRP法研究

将CB—HRP注入鸡腔上囊壁内,支配腔上囊的神经元被标记。支配腔上囊的长轴突型交感节前神经元在胸7—腰荐3(简称T_7—LS_3)髓节的Terni氏柱内,主要位于LS_1—LS_2髓节。在LS_8—LS_(11)髓节中央管背侧和背外侧区有大量标记细胞,主要集中于LS_8髓节,这些标记细胞是支配腔上囊的副交感节前神经元,其轴突大部分行经同侧盆神经到达腔上囊,少数行经对侧的盆神经到达腔上囊。腔上囊的交感节后神经元位于T_6—L_(13)交感干神经节和肾上腺神经节,交感干的标记细胞集中位于LS_9—LS_(11)和LS_2—LS_3。副交感节后神经元位于盆神经和泄殖腔神经节内。在肠神经内有大量的标记细胞。

禽鸟源传染性腔上囊病病毒分离株对鸡的致病性试验

用鸡、鸭、麻雀３种不同源性传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）分离株人工感染８０日龄的ＳＰＦ鸡，初步试验发现，这些病毒均能使接种鸡的腔上囊明显萎缩，组织切片见淋巴滤泡萎缩、坏死，从人工感染的鸡腔上囊组织中可检测和分离到ＩＢＤＶ。各试验组的腔上囊指数平均值分别为：鸡２８３，鸭３１４，麻雀３６４，对照组５１１。经统计学分析（ｔ检验）３个攻毒组与对照组间均有显著差异。

GC_(02)球虫病疫苗对鸡腔上囊发育的影响

将80只1日龄健康雏鸡随机分为GC02球虫病疫苗组（试验组）和对照组（n=40）。试验组鸡于7日龄和14日龄分别口服含8000个孢子化卵囊的GC02球虫病疫苗，对照组鸡口服生理盐水。于21、28、35和42日龄每组随机选取10只鸡，空腹称量体重，颈动、静脉放血致死，立即解剖取腔上囊称重并制作石蜡切片，光学显微镜下观察与拍照，研究了GC02球虫病疫苗对鸡腔上囊发育的影响。结果，试验组鸡腔上囊器官指数低于同日龄对照组，其中28-42日龄鸡的腔上囊器官指数显著或极显著低于对照组（P〈0．05或P〈0．01）。与对照组同日龄鸡相比，试验组鸡免疫GC02球虫病疫苗后，各日龄鸡腔上囊均表现出不同程度的病理组织学变化。试验组雏鸡腔上囊组织结构出现轻微损伤，GC02球虫病疫苗刺激了机体的免疫系统，增加了免疫效果。试验结果提示，GC02球虫病疫苗对雏鸡腔上囊发育有一定的抑制作用，对其组织结构有轻微损伤作用。