近期引起免疫失败的传染性腔上囊病病毒VP2基因的分子特征

用RT-PCR方法从2007年12月在安徽境内发生的两起传染性腔上囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡腔上囊组织样品AH1与AH2中扩增出了传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2基因。序列分析表明,AH1与AH2病毒VP2基因长度均为1 350 nt,编码450 aa,七肽基序均为S-W-S-A-S-G-S,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、QI、、D、AI、和S,具有IBDV强毒的分子特征,AH1和AH2感染的20日龄雏鸡产生明显IBD病变,死亡率为25%(1/4)。同源性分析表明,26个血清Ⅰ型IBDV毒株VP2基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为90.7%～99.6%和95.5%～100%,不同IBDV毒株VP2基因的七肽基序、特征性氨基酸残基以及高变区的亲水性有差异。在进化树上,26个血清Ⅰ型IBDV毒株可分为数组,其中的15个中国分离IBDV毒株不在同组,毒株之间的亲缘关系与分离地区或分离时间没有明显的联系。AH1和AH2与现行商品疫苗毒株B87的VP2基因核苷酸序列的差异率分别为5.3%和5.2%,这也进一步佐证了IBDV野毒VP2基因变异所引起的毒力变化和VP2抗原表位的漂移是导致当前IBD疫苗免疫预防失败的主要原因。

传染性腔上囊病病毒与禽腺病毒混合感染的分子鉴定

应用设计的分别针对传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2蛋白基因高变区(vVP2)和Ⅰ群禽腺病毒(FAV)六邻体(hexon)蛋白基因的特异性PCR引物,对临床疑似IBD病例的2只鸡的腔上囊样品和泄殖腔拭子样品分别进行IBDV和FAV的分子检测。结果显示,通过巢式PCR从2份腔上囊样品中均扩增出了471 bp的IBDV vVP2特异性目的片段;SspⅠ和SacⅠ的酶切分析以及序列测定分析证实,该目的片段属超强毒IBDV(very virulent IBDV,vvIBDV)的特征性序列,与常用疫苗株的亲缘关系较远。从2份泄殖腔拭子样品中均扩增出了900 bp的FAV特异性目的片段;序列测定和遗传进化分析表明,该片段在分子水平上属于血清1型FAV(FAV-1)。结果表明,该病例同时感染了vvIBDV和FAV-1。

鸡传染性腔上囊病病毒Gt株全基因组序列分析及真核表达载体的构建

采用一步法长距离RT-PCR克隆了IBDV Gt株全基因组,对其核苷酸和氨基酸序列进行了系统分析。在IBDV Gt株全基因组中引入分子标签,且在基因组两端分别引入锤头状核酶结构(HamRz)和丁肝病毒核酶结构(HdvRz)。将带有分子标签和核酶结构的IBDV基因组插入载体pCAGGS的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV真核表达载体pCAGGmGtAHRT和pCAG-GmGtBHRT,为IBDV新型高效拯救平台的构建及基于此的病毒基因功能奠定了基础。

鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDVVP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDVVP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku。

鸡传染性腔上囊病病毒双夹心ELISA检测方法的建立

通过制备兔抗鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)、小鼠抗IBDV和绵羊抗兔免疫血清,并纯化绵羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体,采用方阵滴定法测定其最佳使用浓度,建立了IBDV双夹心ELISA检测方法。结果显示,包被抗体的最适稀释度为1∶160,兔抗IBDV的最佳稀释度为1∶200,酶标记抗体的最佳稀释度为1∶400。特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性强,重复性好,与鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡减蛋综合征病毒抗原均不发生交叉反应。对人工感染病例的检测结果表明,建立的双夹心ELISA方法可用于临床快速诊断IBDV。

传染性腔上囊病病毒广西流行株免疫原性的研究

分别制备传染性腔上囊病病毒（IBDV）广西流行毒株040124、BH11、TSC-2（9）和YL052以及参考强毒株CJ801-BKF的灭活油乳剂疫苗（OEV）及其多价OEV,分别进行IBD商品疫苗毒株B87（in）和FW2512对4个广西流行毒株的攻毒免疫保护试验、流行毒株间的免疫交叉保护试验、多价OEV不同免疫剂量及其与CJ801-BKF株OEV的免疫保护对比试验。结果显示,2个IBD商品疫苗均不能对4个流行毒株提供完全的保护;4个流行毒株的OEV对同源毒株的攻毒均可产生100%保护,其中040124株OEV的交叉免疫保护性最好;在毒株免疫组与未免疫组免疫器官指数的比较中发现,TSC-2（9）株OEV免疫鸡的免疫器官受病毒的损伤程度最严重,而040124、BH11和YL052株OEV的免疫均能较好地保护鸡的免疫器官免受病毒的损伤;多价OEV 3个免疫剂量的免疫保护指数（IPI）为80%~100%,1 mL免疫组的IPI显著高于0.25 mL免疫组（P〈0.05）,而1 mL免疫组与0.5 mL免疫组差异不显著（P〉0.05）;多价OEV的免疫效力显著高于毒株YL052、TSC-2（9）和CJ801-BKF的OEV（P〈0.05）。结果表明,本研究制备的多价灭活疫苗适用于本地IBD的防制。

禽鸟源传染性腔上囊病病毒分离株对鸡的致病性试验

用鸡、鸭、麻雀３种不同源性传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）分离株人工感染８０日龄的ＳＰＦ鸡，初步试验发现，这些病毒均能使接种鸡的腔上囊明显萎缩，组织切片见淋巴滤泡萎缩、坏死，从人工感染的鸡腔上囊组织中可检测和分离到ＩＢＤＶ。各试验组的腔上囊指数平均值分别为：鸡２８３，鸭３１４，麻雀３６４，对照组５１１。经统计学分析（ｔ检验）３个攻毒组与对照组间均有显著差异。

传染性腔上囊病病毒的分子流行病学研究

综述了传染性腔上囊病 (IBD)流行的地域差异 ,传染性腔上囊病病毒 (IBDV)

传染性腔上囊病病毒VP3蛋白模拟表位的筛选

为了研究传染性腔上囊病病毒(IBDV)的致病机理及研制有效的IBDV疫苗,利用噬菌体展示技术对IBDV VP3抗原表位进行了筛选。以4株IBDV VP3单克隆抗体HRB-3F、HRB-7B、HRB-7C和HRB-10E作为筛选分子,对噬菌体随机15肽库进行3轮吸附-洗脱-扩增淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中随机挑取20个单克隆噬菌斑,通过间接ELISA和竞争抑制ELISA检测,共选出13个单克隆噬菌斑,经噬菌体gⅢ部分基因的核苷酸序列测定,确定了8个15肽为IBDV抗原表位。这8个15肽在一级结构上没有3个以上连续氨基酸与IBDV Gx(Gen-Bank登录号:AY444873)VP3的氨基酸序列相同,但二级结构上均以β折叠为主,并且与单抗的结合可被VP3蛋白有效地抑制。证实,筛选的是IBDV VP3的模拟表位。

不同传染性腔上囊病病毒株结构蛋白表达差异性研究

目的 :了解不同传染性腔上囊病病毒株 (ICBDV)结构蛋白表达的差异。 方法 :将在不同时间、地域 ,从鸭、麻雀及传染性腔上囊病发病鸡群中获得的 18株 ICBDV,分别用 SPF鸡、鸡胚和鸡胚成纤维细胞增生 ,经氯仿处理后 ,采用聚乙二醇沉淀、超速离心和不连续蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒 ,并对纯化病毒进行 SDS- PAGE分析。 结果 :病毒主要分布于 40 %蔗糖层 ;鸡源、鸭源、麻雀源 ICBDV在 SDS- PAGE中均出现 5条特异的蛋白带 ,各蛋白带的电泳迁移率毒株间差异不明显 ;15株鸡源 ICBDV结构蛋白 VP2 在不同毒株表达量有较大差异。 结论 :不同传染性腔上囊病病毒株结构蛋白 VP2

抗传染性腔上囊病病毒单克隆抗体的特性研究——传染性腔上囊病病毒抗原的培养与提纯

用 2 0 0— 5 0 0g/L蔗糖进行不连续梯度离心可除去传染性腔上囊病病毒 (IBDV)培养液中的大部分杂蛋白 ,经检查提纯的IBDV颗粒结构完整、纯度高 ;经用SDS PAGE分析表明 ,IBDV主要结构蛋白带清晰。提示用超滤浓缩法和蔗糖不连续梯度离心提纯的IBDV抗原均可为进行其他试验的抗原材料。

5种消毒药对鸡传染性腔上囊病病毒的杀灭效果试验

用市售的腆类化合物、氯制剂、双季铵盐类化合物、酚类制剂和醛类制剂与鸡传染性腔上囊病病毒 (IBDV)相混合 ,在 4℃和 3 0℃作用 2 4h ,用 10 0 0ID5 0 的剂量作用后的病毒液感染 2 3日龄健康AA鸡。感染后 72h扑杀试验鸡 ,取其腔上囊 ,用IBD ELISA快速诊断盒检测IBDV抗原 ,仍呈阳性反应 ;用 3mL L的甲醛溶液与IBDV病毒液混合 ,在 3 7℃作用 2 4、3 6和 48h后 ,按以上剂量感染鸡 ,感染后 72h扑杀 ,取其腔上囊 ,用IBD ELISA快速诊断盒检测IBDV抗原 ,全部呈阴性。

传染性腔上囊病病毒超强毒致弱株GZ20 VP2基因的克隆和序列分析

根据已发表的 5 2 / 70株传染性腔上囊病病毒 (IBDV)基因组序列 ,设计并合成了一对特异扩增IBDVVP2基因的引物。以超强毒IBDV (vvIBDV )致弱株GZ2 0基因组为模板利用RT PCR技术扩增出了 1.5kb的cDNA产物 ,将VP2基因克隆于 pUC119质粒上 ,得到重组 pUC119质粒。并对VP2基因全序列测定 ,序列分析和聚类分析表明 ,该致弱株与无毒疫苗株PBG98和弱毒株CU 1非常相似 ,而与经典强毒株、超强毒株和变异株相差较大。这提示该致弱株属于标准血清Ⅰ型弱毒株。

表达传染性腔上囊病病毒VP2蛋白重组乳酸菌的构建及其免疫保护效果

为探讨表达传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2蛋白重组乳酸菌的口服免疫效果,采用RT-PCR方法扩增了1株IBDV流行毒株的VP2基因,再分别亚克隆到干酪乳杆菌和乳酸乳球菌的表达载体pPG2和pNZ8112中,并分别电转化干酪乳杆菌L.casei393和乳酸乳球菌NZ9000的感受态细胞,构建了重组菌pPG2-VP2/L.casei393和pNZ8112-VP2/NZ9000。分别经20 g/L乳糖和1 ng/mL的乳链菌肽诱导表达后,对菌体裂解物进行了SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,重组菌pPG2-VP2/L.casei393和pNZ8112-VP2/NZ9000的裂解物中分别出现大小约为53 ku和50 ku的反应带,大小均与预期结果相符,表明目的蛋白在重组菌中得到了表达。重组菌pPG2-VP2/L.casei393和pNZ8112-VP2/NZ9000分别口服免疫SPF雏鸡后,均刺激机体产生了特异性抗IBDV VP2蛋白的血清抗体;攻毒保护试验结果显示,其保护指数分别为62.5%和37.5%,表明重组菌免疫雏鸡后,对IBDV的攻击均具有不同程度的免疫保护作用。

引起免疫失败的传染性腔上囊病病毒VP2基因在大肠杆菌中的表达

将从安徽省传染性腔上囊病(IBD)免疫失败的病鸡腔上囊组织中扩增的VP2基因定向克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了原核表达质粒pGEX-VP2,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3);经IPTG诱导后,用IBDV双抗体夹心ELISA检测,结果呈阳性反应;SDS-PAGE分析结果显示,重组VP2融合蛋白的分子质量为68ku,表达量约占菌体总蛋白量的16.0%,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体内;Western-blotting结果显示,重组VP2蛋白与IBDV抗体发生反应,形成一条特异性蛋白带,表明获得的重组蛋白具有良好的抗原反应性。

鸡传染性法氏囊病毒强毒株(vvIBDV)VP_2高变区的替换

采用双融合PCR(doublefusionPCR)的方法将鸡传染性法氏囊病毒 (IBDV)的强毒株的VP2 片段替换为疫苗株的相应片段以获得重组的病毒粒子。首先将被替换片段两侧的片段从强毒株的载体上扩增下来 ,并将目的片段从疫苗株序列的载体上扩增下来。然后用融合PCR的方法将目的片段与其上游片段融合起来 ,回收产物并将其与下游片段融合起来 ,最终得到了替换后的新序列。双融合PCR提供了一种快速、精确和不受酶切位点限制的片段替换方法。

黄芪多糖对人工感染IBDV雏鸡红细胞免疫功能的影响

将由未免疫接种腔上囊病疫苗鸡的种蛋孵化而来的160只1日龄海兰白雏鸡随机分为A、B、C和D共4组。A组为对照组，B、C和D组于26日龄时按每只0．3mL的剂量用IBDV攻毒。A、B组未用黄芪多糖（APS）处理，C、D组从攻毒当日起连续胸肌注射APS6d，剂量分别为每只鸡5mg和10mg。分别在21、29、32、35、38日龄时心脏采血1～3mL，测定E—C3bRR、E—ICRR、ERER和ERIR。结果显示，雏鸡感染IBDV后可使E-C3bRR和ERER显著降低（P〈0．01）；APS处理组E-C3bRR、E-ICRR、ERER均高于A、B组（P〈0．01），其中D组最高，而ERIR则与A组相似。证实，雏鸡感染IBDV后红细胞免疫功能低下，而APS可显著提高其红细胞免疫功能。

IBDV感染鸡免疫器官淋巴细胞中细胞凋亡调控蛋白的动态表达

用鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)SNJ93株、BC6/85株、B87株感染SPF鸡后观察免疫器官淋巴细胞中Bcl 2和Bax蛋白的分布定位和动态变化。结果,B87株接种组的腔上囊、脾、胸腺淋巴细胞中这两种蛋白在各检测时间均为阴性反应;SNJ93与BC6/85攻毒组胸腺淋巴细胞中这两种蛋白呈现阴性反应,SNJ93攻毒组腔上囊和脾淋巴细胞在48h即开始出现Bcl 2和Bax阳性反应,腔上囊淋巴细胞内这两种蛋白在感染后72、96、120h呈现明显的强阳性反应,以后开始降低,脾淋巴细胞中这两种蛋白在感染后72、96h出现强阳性反应;BC6/85攻毒组腔上囊淋巴细胞中只在96、120h出现阳性反应,脾淋巴细胞中只在96h呈现阳性反应。用免疫组化法检测Bax和Bcl 2,有可能为IBDV毒力划分增添新的依据。