人胚鼻咽上皮细胞培养、化学转化及鼻咽癌恶性转化基因的克隆

鼻咽癌是我国南方和东南亚国家相当高发的恶性肿瘤。湖南省鼻咽癌的死亡率在全国列第四位,严重危害人民的生命健康。有效地防治鼻咽癌已提到十分突出的位置。但迄今为止,鼻咽癌的病因发病机理尚不清楚。人们试图从流行病学、病理学、分子生物学等方面进行探讨,也取得了一些有意义的研究结果,但未能系统、

人胚鼻咽上皮细胞cDNA文库的构建及鼻咽癌相关基因的筛选

为了进一步分离人鼻咽组织特异性表达基因和鼻咽癌特异相关基因 ,采用SMART (switchingmechanismat 5′endofRNAtranscript)技术 ,构建了人胚鼻咽上皮cDNA文库 .从原代培养的人胚鼻咽上皮分离总RNA并纯化mRNA ,利用经修饰的oligo (dT)引物 (含sfiⅠB酶切位点 )合成cDNA第一链 ,同时根据真核生物mRNA5′端帽子结构特点 ,利用SMART核苷酸 (含sfiⅠA酶切位点 )作为cDNA第一链在mRNA 5′端延伸出去的模板 ,进而以此序列为引物利用LD PCR (long distance PCR)合成双链cDNA ,双链cDNA经sfiⅠ (ⅠA和ⅠB)酶切和过柱分级分离后 ,克隆入经sfiⅠ酶切的λTrip1EX2载体后经体外包装而成cDNA文库 .结果表明 ,原始人胚鼻咽上皮cDNA文库获得 1 0× 10 6个重组子 ,重组率达 96 % .文库扩增后 ,滴度达 7 8× 10 9pfu ml,插入cDNA平均长度为 1 2kb ,用PCR从该文库扩增出本实验室新克隆的鼻咽癌相关基因NAG4的全长cDNA .构建的人胚鼻咽上皮cDNA文库具有良好的质量 ,该cDNA文库为进一步筛选。

鼻息肉组织中核转录因子-κB、Toll样受体2及上皮克隆蛋白的表达及其意义

目的探讨鼻息肉组织中核转录因子-κB(NF-κB)、Toll样受体2(TLR2)和腭、肺及鼻咽上皮克隆蛋白(PLUNC)的表达及其意义。方法采用回顾性研究,收集本院90例鼻息肉组织标本(病例组),另收集45例正常鼻甲黏膜组织标本(对照组)。采用苏木精-伊红染色检测两组嗜酸性粒细胞浸润程度,根据免疫组化法检测两组NF-κB p65、TLR2及PLUNC的分布及其表达水平,对病例组鼻息肉组织中NF-κB p65、TLR2及PLUNC的表达情况进行相关性分析。结果相比对照组,病例组鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞阳性率升高(P<0.01)。病例组鼻息肉组织中NF-κB p65和TLR2表达阳性率高于对照组,PLUNC表达阳性率低于对照组(P<0.001)。鼻息肉组织中TLR2与NF-κB p65表达呈正相关,PLUNC与NF-κB p65、TLR2均呈负相关(P均<0.05)。结论鼻息肉组织中NF-κB p65、TLR2表达升高、PLUNC表达降低,三者表达强度有关。

PLUNC基因启动子区多态位点C-1888T与变应性鼻炎易感性

目的分析变应性鼻炎患者中腭、肺及鼻咽上皮克隆(palate,lung and nasal epithelium clone,PLUNC)基因表达变化,探讨PLUNC基因启动子区多态位点C-1888T是否与变应性鼻炎的易感/风险相关。方法选取2021年1月至2022年2月在广西中医药大学附属瑞康医院就诊治疗的变应性鼻炎患者225例,同时选取150例正常人为对照组,抽取外周血,比较PLUNC基因在两组人群中的表达差异;鉴定变应性鼻炎患者C-1888T多态位点3种基因型,检测不同基因型的表达频率及不同基因型中PLUNC基因的mRNA表达水平。结果变应性鼻炎患者外周血中PLUNC基因的表达较正常人群降低(P=0.000);C-1888T多态位点TT基因型及T等位基因频率显著高于对照组,且TT型外周血PLUNC基因mRNA表达水平显著低于CC型及CT型,差异有统计学意义(P=0.000)。结论变应性鼻炎患者PLUNC基因表达水平下调,C-1888T多态位点为TT型的个体更易患变应性鼻炎(OR=9.375,P=0.000)。

RACE法克隆湖羊SPLUNC1基因及序列分析

通过克隆湖羊短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)基因的cDNA序列,为研究其蛋白的结构和功能奠定基础。参照GenBank上牛、山羊的SPLUNC1基因的cDNA序列,设计简并引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,测序后进行拼接,获得湖羊SPLUNC1基因cDNA全长序列,并对序列进行分析。结果表明:克隆的湖羊SPLUNC1基因cDNA序列全长为1 091bp(GenBank登录号KJ749828),其中开放阅读框为768bp,共编码255个氨基酸。构建的氨基酸进化树结果显示湖羊SPLUNC1与预测绵羊的氨基酸同源性最高,山羊次之。

鼻咽癌相关固有免疫分子及其潜在临床转化前景

鼻咽癌是我国南方常见恶性肿瘤,目前其早期诊断仍面临巨大的困难。本课题组运用基因组学、转录组学、蛋白质组学和组织微阵列等高通量技术大规模筛选鼻咽癌分子标记物,发现在鼻咽上皮分泌的两类重要的固有免疫分子——腭、肺及鼻咽上皮克隆蛋白家族和乳转铁蛋白,不仅是构成机体天然防御系统的重要组成部分,还通过特定的信号转导通路引起一系列的生物学效应,影响鼻咽癌的发生、发展进程,有望应用于鼻咽癌的早期诊断、个体化治疗及临床预后。

短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1与耳鼻咽喉科疾病

短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（short palate lung and nasal epithelium clone 1,是近年发现的一个特异性表达在呼吸道的天然免疫分子，其结构与杀菌／渗透性增加蛋白（bactericidal/permeability increasing protein, BPI）相似，且具有明显的疏水性，在免疫防御中发挥着重要的作用，参与对外界刺激的反应，与耳鼻咽喉科多种疾病包括感染、变态反应和肿瘤等相关。本文将对SPLUNC1在耳鼻咽喉科的新进展做一综述。

盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因克隆及序列分析

为了克隆盘羊与巴什拜羊杂交后代短鄂、肺及鼻咽上皮细胞克隆1(SPLUNC1)基因cDNA全长序列,本研究根据GenBank上已公布的牛、山羊的SPLUNC1基因序列来设计简并引物,以盘羊与巴什拜羊杂交F1代为材料,克隆出盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的片段序列,再利用RACE法克隆其SPLUNC1基因3′端和5′端,测序后拼接获得SPLUNC1基因全长cDNA序列。结果显示,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因的cDNA全长为1117 bp,5′非编码区(UTR)为84 bp,3′UTR为265 bp,开放阅读框(ORF)为768 bp,编码255个氨基酸。预测该基因编码蛋白的等电点5.006,分子量26.57 kDa。系统进化分析表明,盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1氨基酸序列与绵羊的氨基酸序列同源性最高。本研究克隆了盘羊与巴什拜羊杂交后代SPLUNC1基因全长cDNA序列,为后续深入研究该杂交后代SPLUNC1基因的功能奠定基础。

重组SPLUNC1蛋白对感染绵羊肺炎支原体的盘羊杂交羊的免疫调节作用研究

为研究重组SPLUNC1蛋白对感染绵羊肺炎支原体(MO)后的盘羊杂交羊免疫调节作用,本研究将6只巴什拜羊分为A组,18只盘羊杂交羊随机分为B、C、D组,对实验羊人工感染MO后第5 d,C组气管注射巴什拜羊重组SPLUNC1蛋白、D组气管注射盘羊杂交羊重组SPLUNC1蛋白,每天150μg/只;A、B组每天气管注射等量的生理盐水作为对照组。采用ELISA方法检测各组羊血清中MO抗体水平以及IL-8、IL-12、IL-13表达水平。结果显示,感染前所有实验羊MO抗体均为阴性,感染后第14 d所有实验羊MO抗体均为阳性;IL-8水平在感染后第14 d^21 d,A、C、D组极显著和显著地低于B组(p<0.01;p<0.05;p<0.01)。IL-12水平在感染后第14 d,A、C和D组极显著和显著地低于B组(p<0.01;p<0.05;p<0.01),第21 d时,A、C和D组极显著低于B组(p<0.01)。IL-13水平在感染后第5 d,A组显著低于B、C和D组(p<0.05),在第7 d^21 d,A、C、D组显著和极显著低于B组(p<0.05;p<0.01;p<0.01)。实验数据表明重组SPLUNC1蛋白对盘羊杂交羊具有明显的免疫调节作用。本研究为绵羊支原体肺炎的治疗提供了实验依据。

巴什拜羊重组SPLUNC1蛋白对体外培养的绵羊肺炎支原体生长的影响

为研究重组巴什拜羊短腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(rSPLUNC1)对体外培养的绵羊肺炎支原体(MO)生长的影响,本研究以不同浓度(10μg/mL、20μg/mL及40μg/mL)的rSPLUNC1添加于MO培养液中进行培养,并采用平板菌落计数和荧光定量PCR方法检测其对MO的增殖水平。结果显示:平板菌落计数中,3个rSPLUNC1浓度组菌落数分别比对照组减少37.25%(p<0.01)、48.74%(p<0.01)及67.23%(p<0.01);荧光定量PCR检测结果显示,2 h后实验组MO 16S rRNA拷贝数降低,4 h时拷贝数最低,3个rSPLUNC1浓度组的拷贝数比对照组降低2.96%(p>0.05)、92.57%(p<0.01)、93.75%(p<0.01)。研究表明,rSPLUNC1对体外培养的MO具有显著的抑制作用。

湖羊SPLUNC1基因序列的生物信息学分析

以湖羊SPLUNC1基因为研究对象,利用生物信息学方法对其编码的蛋白进行理化性质、信号肽、跨膜区域、亚细胞定位、二级结构、三级结构、保守区域分析,并构建系统发育树。结果表明,湖羊SPLUNC1蛋白的分子量为26.53 ku,理论等电点为5.07。SPLUNC1蛋白N端存在信号肽,亚细胞定位在细胞外。SPLUNC1蛋白质的二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲。该蛋白由4股反平行的肽段形成的β折叠片和2个α螺旋组成的桶形结构域组成。系统发育树分析表明,湖羊的SPLUNC1蛋白在山羊、牛、猪、人、小鼠中,与山羊首先聚为一类,后与牛聚为一类,这与动物学分类结果一致。

复发性鼻息肉患者PLUNC、TLR2和HO-1蛋白表达及意义

目的探讨复发性鼻息肉患者腭、肺及鼻咽上皮克隆(PLUNC)蛋白、Toll样受体2(TLR-2)蛋白和血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白表达及意义。方法选取2016年1月至2017年10月在我院治疗的鼻息肉患者75例,其中初发性鼻息肉患者40例(初发组)、复发性鼻息肉患者35例(复发组),同时选取40例正常中鼻甲黏膜者作为对照组,采用免疫组织化学法检测PLUNC、TLR2和HO-1蛋白表达情况。结果复发组PLUNC蛋白阳性表达率为17.14%,明显低于初发组和对照组(P<0.05);初发组PLUNC蛋白阳性表达率为45.00%,明显低于对照组(P<0.05);复发组TLR-2和HO-1蛋白阳性表达率为91.43%和85.71%,明显高于初发组和对照组(P<0.05);初发组TLR-2和HO-1蛋白阳性表达率为52.50%和55.00%,明显高于对照组(P<0.05);PLUNC与TLR2、HO-1蛋白表达呈负相关(rs=-0.622和-0.534,P<0.05),TLR2和HO-1蛋白表达呈正相关(rs=0.466,P<0.05)。结论鼻息肉患者PLUNC蛋白表达下调,而TLR2和HO-1蛋白表达上调,3种蛋白的表达与鼻息肉复发有一定的相关性,且三者之间存在相关关系。

脂多糖诱导SPLUNC1基因的表达

目的了解脂多糖(LPS)对人支气管上皮细胞(HBECs)增殖的影响,通过观察不同浓度脂多糖(LPS)不同时间诱导HBECs的短上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)基因表达情况,探讨SPLUNC1在呼吸道感染中的作用。方法采用0.01、0.1、1.0、10 mg/L LPS诱导HBECs,通过噻唑蓝(MMT)法检测LPS对HBECs增殖的影响,诱导HBECs 2、4、8、16、24 h后通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测SPLUNC1基因表达情况,结果以SPLUNC1/GAPDH基因拷贝数比值表示。结果 0.01、0.1、1.0、10 mg/L的LPS均可抑制HBECs的生长[吸光度(A值):0.48±0.03、0.37±0.01、0.30±0.03、0.27±0.02,相对生长指数:94.12%、72.55%、58.82%、52.94%],并能诱导SPLUNC1基因表达上调;在同一浓度组,LPS刺激细胞2 h后SPLUNC1基因表达开始上调,随着时间延长逐渐升高,呈时间依赖性[0.01 mg/L组2、4、8、16、24 h分别为0.19±0.03、0.24±0.04、0.26±0.03、0.44±0.05、0.51±0.07;0.1 mg/L组分别为0.43±0.02、0.52±0.05、0.60±0.06、0.63±0.08、0.68±0.05;1.0 mg/L组分别为0.44±0.02、0.48±0.02、0.50±0.03、0.58±0.05、0.70±0.06;10 mg/L组分别为0.34±0.03、0.38±0.04、0.68±0.05、0.96±0.08、0.98±0.07],不同时间点组间比较差异有统计学意义(均P<0.01)。结论 LPS可抑制HBECs的生长,能诱导HBEC细胞SPLUNC1基因表达上调,并在一定浓度范围内表达呈时间依赖性,推测SPLUNC1可能参与细菌感染最初的防御。

天然免疫相关蛋白分子SPLUNC1载体构建及蛋白稳定表达

固有免疫应答在保护机体避免细菌感染中发挥着重要作用,如果固有免疫应答出现紊乱,则会加重感染和炎症反应。在呼吸道,黏膜分泌的多种蛋白如杀菌性/通透性增强蛋白（bactericidal/permeabilityincreasing protein,BPI）等能够通过参与固有免疫应答来清除呼吸道入侵的细菌,避免呼吸道感染[1]。

重组SPLUNC1抑菌及调节NE活性的研究

为研究重组绵羊短腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(rSPLUNC1)的抑菌活性及对中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性的调节作用,本实验采用微量稀释法测定rSPLUNC1对巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌生长的抑制作用;采用显色底物检测法测定rSPLUNC1对NE活性的调节作用。抑菌检测结果表明10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL rSPLUNC1能够极显著地抑制巴氏杆菌、大肠杆菌的生长(p<0.01),并且呈剂量效应;显色底物检测结果表明10μg/mL和20μg/mL^40μg/mL rSPLUNC1可以显著和极显著地提高绵羊肺炎支原体(Mo)感染的外周中性粒细胞NE的活性(p<0.05,p<0.01)。表明rSPLUNC1能够抑制革兰氏阴性菌的生长并提高NE活性,可能有助于机体抵御呼吸道的感染。

盘羊杂交羊SPLUNC1融合蛋白的真核表达

为构建盘羊杂交羊SPLUNC1基因的真核表达载体并在巴斯德毕赤酵母中表达,从盘羊杂交羊口腔上颚的上皮细胞中提取总RNA,并反转录成c DNA,以该c DNA为模板采用逆转录PCR(RT-PCR)法克隆盘羊杂交羊SPLUNC1基因开放阅读框,并克隆到p PIC9K载体中,构建真核表达载体p PIC9K-SPLUNC1,再将重组质粒电转至毕赤酵母GS115中进行表达,表达产物经Ni-NTA琼脂亲和层析纯化,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western Blot)方法检测。结果显示,目的基因大小758 bp,重组表达质粒p PIC9K-SPLUNC1经双酶切、PCR及测序鉴定构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,可见大小为25.96 ku的目的条带,且在72 h表达量最大;纯化后经SDS-PAGE和Western Blot分析,可见大小为25.96 ku的目的条带。研究结果表明,利用真核表达系统在体外成功表达并纯化了盘羊杂交羊r SPLUNC1蛋白,为深入研究盘羊杂交羊SPLUNC1蛋白的生物学功能奠定基础。

新型抗菌肽α4-短肽体外对铜绿假单胞菌的抑制作用

目的探讨抗菌肽α4-短肽体外对铜绿假单胞菌生长的抑制作用,为临床治疗以铜绿假单胞菌为主的肺部感染性疾病提供新思路。方法体外观察α4-短肽对铜绿假单胞菌标准株PAO1体外生长曲线和生物膜形成的影响,并分析α4-短肽对PAO1刺激后巨噬细胞(RAW264.7)炎症水平的影响。选取若干株临床耐药菌株,体外观察α4-短肽对其生长曲线的影响。结果α4-短肽可抑制PAO1生长及生物膜的形成,8μmol/L时效果达最佳(P<0.001)。α4-短肽预处理RAW264.7后,由PAO1引起的IL-6和TNF-α的mRNA表达下调,8μmol/L时效果最佳(P<0.001)。分离得到4株铜绿假单胞菌多重耐药菌株和2株肺炎克雷伯菌耐药菌,α4-短肽对其生长均产生较好的抑制作用。结论α4-短肽能较好地抑制铜绿假单胞菌生长及其生物膜形成,降低铜绿假单胞菌导致的炎症水平,并对临床耐药菌株有较好的抑制效果。

LPS对A549和Hela细胞SPLUNC1蛋白表达的影响

目的探讨脂多糖(LPS)对人肺腺癌上皮A549细胞和人子宫颈癌上皮Hela细胞短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)蛋白表达的影响。方法将两类细胞各随机分为对照组、实验组,CCK-8法观察LPS与细胞增殖活性的时间-反应和剂量-反应关系,筛选各自的最佳效应浓度和作用时间,以LPS最佳效应浓度和作用时间处理后,免疫组化和免疫荧光定量法检测两类细胞SPLUNC1蛋白相对表达量的变化。结果 LPS对A549细胞的最佳效应浓度为20 mg/L,最佳效应时间为12 h,对Hela细胞的最佳效应浓度为40 mg/L,12~24 h为其最佳效应时间窗。SPLUNC1在两类细胞中均呈阳性表达,LPS处理后表达均显著上调(P <0. 05),两类细胞间比较,LPS处理后Hela细胞SPLUNC1相对表达量高于A549细胞(P <0. 05),较对照的增量值(Δ)也明显大于A549细胞(P <0. 05)。结论 SPLUNC1在宫颈癌细胞中存在表达,可能是肺腺癌和宫颈癌病变中的保护性因子,具有潜在的临床应用价值。

感染绵羊肺炎支原体后绵羊SPLUNC1 mRNA表达水平监测

为检测绵羊感染绵羊肺炎支原体(MO)前后的短腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1(SPLUNC1)表达水平变化,对6只巴什拜羊和6只盘羊杂交羊分别人工感染MO,在感染前(第0天)和感染后第5、14、21天,采集口腔喉咽部的上腭组织,用Real-time PCR方法检测SPLUNC1mRNA的表达水平。结果:感染后两组羊SPLUNC1 mRNA的相对表达水平均升高,在感染后第14~21天,巴什拜羊SPLUNC1 mRNA水平均极显著高于盘羊杂交羊(P<001)。该结果说明在临床上表现为抗MO感染的巴什拜羊,体内可表达高水平的SPLUNC1 mRNA,这为巴什拜羊抗MO感染的机理研究提供一定的参考依据。

PLUNC、TLR2及NF-κB在鼻息肉组织中的表达及意义

目的:检测鼻息肉组织及正常下鼻甲黏膜腭肺鼻上皮克隆(PLUNC)、Toll样受体2(TLR2)、核转录因子-κB(NF-κB)的表达情况,分析三者表达的相关性,探讨其在鼻息肉发病机制中的作用及临床意义,为鼻息肉的治疗提供理论依据和新的思路。方法:收集2013-06-2014-12期间郑州大学第一附属医院住院的患者标本。以慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者的息肉组织为实验组(46例),以鼻中隔偏曲矫正术患者的正常下鼻甲黏膜为对照组(19例)。苏木精-伊红染色法测定实验组和对照组嗜酸粒细胞(EOS)浸润情况,免疫组织化学技术测定PLUNC、TLR2及NF-κBp65在实验组及对照组中的表达及其分布,探讨PLUNC、TLR2及NF-κBp65在实验组和对照组中的阳性表达情况及其相关性。结果:实验组EOS浸润程度明显高于对照组(χ~2=12.01,P<0.05)。实验组PLUNC的表达明显低于对照组(χ2=16.09,P<0.05),实验组TLR2、NF-κBp65表达明显高于对照组(χ~2=23.74、χ~2=18.59,P<0.05)。相关性分析显示,实验组PLUNC与TLR2、NF-κBp65呈负相关(r=-0.675、r=-0.550,P<0.05),TLR2与NF-κBp65呈正相关(r=0.540,P<0.05)。EOS浸润程度与TLR2及NF-κBp65呈正相关(r=0.417、r=0.470,P<0.05),与PLUNC呈负相关(r=-0.859,P<0.05)。结论:鼻息肉较正常下鼻甲黏膜组织中PLUNC明显降低,TLR2及NF-κB表达明显升高,提示天然免疫功能的下降,感染性因素的加剧,可能与鼻息肉的发病机制有关。