RNA干扰原代培养胚胎腭间充质细胞Smad2/3基因对atRA阻滞细胞周期作用的影响

目的:证实atRA可以通过Smad2/3作用于p21,从而导致胚胎腭间充质细胞周期受阻而出现腭裂。方法:原代培养胎鼠胚胎腭间充质细胞并进行鉴定。采用RNA干扰原代培养胚胎腭间充质细胞Smad2/3基因后,Western印迹检测Smad2/3、pSmad2、pSmad3和p21的蛋白表达水平及干扰后细胞周期的变化。采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析和t检验。结果:经过免疫组化鉴定,证实原代培养C57BL/6N胎鼠腭突间充质细胞成功,并且Smad2/3siRNA可以有效干扰Smad2/3在原代培养MEPM细胞中的表达。Western印迹检测结果证实,Smad2/3siRNA可以通过敲减atRA诱导的Smad2/3表达增高现象,继而降低atRA诱导的p21表达增高现象。此外,Smad2/3siRNA在一定程度上降低了atRA诱导的胎鼠腭突间充质细胞G1期阻滞现象。结论:Smad2/3通过p21参与atRA诱导的胚胎腭突间充质细胞G1期阻滞现象。

全反式维A酸对小鼠胚胎腭间充质细胞成骨分化的抑制作用及其机制

目的探讨全反式维A酸(atRA)对小鼠胚胎腭间充质细胞(MEPM)成骨分化的影响及其机制。方法分离培养MEPM细胞,在成骨诱导(OM)培养基中分别加入atRA 0.1和1.0μmol·L-1,分别于培养1,3,5,7和9 d用MTT法测定细胞存活率,化学比色法检测碱性磷酸酶(ALP)活性。培养21 d后,Von-Kossa染色观察矿化面积比。培养9 d后,逆转录PCR(RT-PCR)检测成骨相关基因Runx2、骨桥蛋白以及骨形态发生蛋白受体(Bmpr)1b,Bmpr2和Smad5 mRNA的表达水平。结果培养9 d后,与正常对照组相比,OM及OM+atRA 0.1和1.0μmol·L-1组细胞存活率明显降低(P<0.05);OM组细胞ALP活性最高,OM+atRA 1.0μmol·L-1组ALP活性明显低于OM组(P<0.05)。培养21 d后,Von-Kossa染色结果显示,OM+atRA 1μmol·L-1组矿化结节面积比为(3.56±1.24)%,明显低于OM组(10.33±2.29)%(P<0.05)。培养9 d后,OM组的Runx2相对表达各组内最高,OM+atRA 1.0μmol·L-1组与其相比约下调20%(P<0.05)。与正常对照组相比,OM组、OM+atRA 0.1和1.0μmol·L-1组骨桥蛋白mRNA表达明显升高(P<0.05)。OM组的Bmpr1b mRNA表达水平为正常对照组的1.6倍,OM+atRA 1.0μmol·L-1组的相对表达仅为OM组的33%(P<0.05)。OM+atRA 1.0μmol·L-1组Smad5 mRNA的表达水平明显低于OM组(P<0.05)。结论atRA能抑制MEPM的成骨分化,其作用机制可能与其下调Bmpr1b影响BMPR信号有关。

miR-135a-5p靶向抑制Kif3B调控小鼠腭胚突间充质细胞的自噬

背景:研究表明,在地塞米松诱导腭裂的小鼠胚胎腭突间充质细胞中miR-135a-5p呈高表达,初级纤毛及其介导的Shh信号通路参与小鼠胚胎腭突间充质细胞的自噬。由此猜测miR-135a-5p可能通过初级纤毛及其介导的Shh信号途径调控小鼠胚胎腭突间充质细胞的自噬。目的:探讨miR-135a-5p对小鼠胚胎腭突间充质细胞自噬的调控作用。方法:体外提取并培养C57BL/6J小鼠胚胎腭突间充质细胞。细胞转染分别设置为:①对照组、miR-135a-5p阴性对照组、miR-135a-5p模拟物组。②NC+miR-NC组、KIF3B过表达组、miR-135a-5p+KIF3B组。qRT-PCR验证miR-135a-5p、KIF3B的转染效率;透射电镜观察各组细胞中自噬小体/自噬溶酶体的数目;免疫荧光技术测定自噬标记物LC3B的荧光表达程度;Western blot检测KIF3B、LC3和P62的蛋白表达。③miR-135a-5p阴性对照组、SAG处理组、SAG+miR-135a-5p组。qRT-PCR检测Shh信号下游关键转录因子Gli3的mRNA表达水平;Western blot检测自噬相关蛋白LC3和P62的蛋白表达。结果与结论:①过表达miR-135a-5p后,细胞内自噬小体/自噬溶酶体数量显著增多(P<0.01);LC3B的荧光密度显著升高(P<0.01),KIF3B、P62的蛋白表达降低(P<0.01),LC3的蛋白表达升高;②过表达KIF3B后,细胞内自噬小体/自噬溶酶体数目明显减少(P<0.01),LC3B的荧光密度降低(P<0.01),P62的蛋白表达升高(P<0.01),LC3的蛋白表达下降(P<0.01);miR-135a-5p靶向抑制KIF3B的表达(P<0.01),并使自噬小体/自噬溶酶体数目、LC3B的荧光强度以及LC3的蛋白表达得到回升(P<0.01),P62的蛋白表达下降(P<0.01);③SAG使Gli3的mRNA表达明显升高(P<0.01),P62的蛋白表达升高(P<0.01),LC3的蛋白表达下降(P<0.01);加入miR-135a-5p后,Gli3的mRNA表达显著下降(P<0.01),P62的蛋白表达下降(P<0.01),LC3的蛋白表达回升(P<0.01);④结果表明:miR-135a-5p靶向抑制KIF3B并且可能通过负向调控Shh信号通路促进小鼠胚胎间充质细胞自噬。

lncRNA Meg3在全反式维甲酸和转化生长因子β3影响小鼠腭突间充质细胞增殖过程中的作用

目的:探索长链非编码RNA(lncRNA)Meg3在全反式维甲酸(atRA)和转化生长因子β3(TGF-β3)影响胎鼠腭突间充质细胞增殖过程中的作用。方法:分离、培养妊娠13 d胎鼠腭突间充质细胞。EdU法检测对照组(未处理)、atRA组(5μmol/L atRA)和TGF-β3组(10μg/L TGF-β3)处理48 h腭突间充质细胞增殖能力的变化。荧光原位杂交和实时荧光定量PCR法检测上述3组Meg3的定位和相对表达量。利用EdU实验检测Meg3 siRNA转染前后atRA和TGF-β3对腭突间充质细胞增殖的影响。结果:与对照组相比,atRA处理48 h可抑制腭突间充质细胞的增殖,TGF-β3处理48 h可促进腭突间充质细胞增殖(P<0.05)。与对照组相比,atRA可促进腭突间充质细胞中Meg3的表达,TGF-β3可抑制Meg3的表达(P<0.05)。Meg3基因沉默后,与对照组相比,Meg3 siRNA组、atRA和TGF-β3处理组胎鼠腭突间充质细胞增殖能力均增强(P<0.05)。结论:atRA对胎鼠腭突间充质细胞的增殖抑制作用可能主要通过Meg3介导,而TGF-β3对腭突间充质细胞增殖的促进作用可能与Meg3基因无直接关系。

小鼠胚胎腭突间充质细胞的分离与体外培养方法研究

目的改进小鼠胚胎腭突取材方法,原代培养C57BL/6J小鼠胚胎腭突间充质细胞并加以纯化。方法通过改良方法在显微镜下切取胚胎腭突,然后应用DISPASE酶消化离体腭突,纯化腭突胚胎间充质细胞,免疫荧光染色法鉴定腭突间充质细胞生物学特性。结果改良的取材方法使小鼠胚胎腭突取材更精确,操作更简单;纯化后的原代间充质细胞几乎不含上皮细胞;免疫荧光显示细胞HNK-1、S-100、波形蛋白标记阳性,角蛋白标记阴性。结论建立了一种小鼠胚胎腭突精确取材及纯化腭突外胚间充质细胞的方法,为下一步研究工作打下基础。

原代培养小鼠胚胎腭突间充质细胞的纯化方法研究

目的:建立纯化原代培养的小鼠胚胎腭突间充质细胞的纯化方法。方法:应用D ispase酶4℃消化处理离体小鼠胚胎腭突18 h,通过振荡法使上皮和间充质分离,吸去上皮片。结果:应用流式细胞仪检测,胚胎腭突间充质细胞内几乎不含上皮细胞。结论:本方法为体外研究提供了理想的模型。

atRA对C57BL/6N小鼠腭突间充质细胞周期分布的影响及其作用机制

目的:在全反式维A酸(all-trans retinoic acid,atRA)诱导建立腭裂小鼠模型的基础上,检测胎鼠体内胚胎腭突间充质细胞的周期分布,并检测相关周期蛋白的变化情况,为进一步阐明维A酸(retinoic acid,RA)诱导腭裂机制提供新的线索。方法:以atRA建立C57BL/6N胎鼠腭裂模型,采用流式细胞术及免疫组化检测小鼠胚胎腭突间充质细胞的周期分布,通过实时定量RT-PCR和Western印记法检测p21和pRb在胎鼠胚胎腭突间充质中的mRNA和蛋白表达水平。采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析和t检验。结果:流式细胞术及免疫组化检测发现,在小鼠妊娠日(gestation day,GD)第10天时给予atRA,可以诱导胎鼠胚胎腭突间充质细胞在一定妊娠阶段出现G1期细胞周期阻滞,同时也使胎鼠胚胎腭突间充质内p21和pRb的表达水平出现改变。而妊娠第12天(GD12)时给予atRA则无此现象。结论:p21与pRb参与了GD10时给予atRA诱导组胎鼠胚胎腭突间充质细胞G1期阻滞的发生。

TCDD致胎鼠腭裂模型中miR-381-3p下调抑制腭间充质细胞成骨分化的实验研究

目的探讨2, 3, 7, 8-四氯二苯二英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)致胎鼠腭裂模型中miR-381-3p下调与胎鼠腭间充质(mouse embryonic palatal mesenchymal,MEPM)细胞成骨分化抑制的相关性。方法 32只6~8周龄SPF级建康C57BL/6J孕鼠随机分为TCDD组与对照组,每组16只。于胚胎日第10.5天(embryonic day 10.5,E10.5)时,TCDD组一次性灌胃TCDD(28μg/kg)、对照组给予等量玉米油。于E13.5和E14.5取出两组胎鼠大体观察腭突组织后,取E13.5和E14.5腭突组织行实时荧光定量PCR检测miR-381-3p表达;E14.5腭突组织Western blot检测成骨特异性转录因子RUNX2和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达。取对照组E14.5胎鼠腭突分离培养MEPM细胞,取第3代细胞以含10 nmol/L TCDD的完全培养基培养,于0、0.5、1、2、3 d检测miR-381-3p表达,0、1、2、3 d检测RUNX2和OPN蛋白表达。另取第3代MEPM细胞随机分为4组,沉默表达组及对照组分别转染miR-381-3p抑制物及抑制物对照,过表达组及对照组分别转染miR-381-3p模拟物及模拟物对照。转染48 h后,检测各组miR-381-3p及RUNX2和OPN蛋白表达。结果 E13.5和E14.5时对照组获得活胎鼠96只、TCDD组92只;其中,E14.5对照组活胎鼠可见双侧腭突接触,TCDD组双侧腭突中间有间隙。TCDD组胎鼠腭突组织miR-381-3p以及RUNX2、OPN蛋白相对表达量均明显低于对照组(P<0.05)。TCDD处理MEPM细胞0.5和1 d后miR-381-3p相对表达量较0 d时明显下降(P<0.05),2、3 d时表达量明显上升,与0 d时比较差异无统计学意义(P>0.05);1、2、3 d时RUNX2及OPN蛋白相对表达量均较0 d时显著降低(P<0.05)。MEPM细胞转染48 h后,沉默表达组miR-381-3p及RUNX2、OPN蛋白相对表达量均较其对照组下降,过表达组均较其对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在TCDD致胎鼠腭裂模型中,miR-381-3p表达下调可能抑制胎鼠MEPM细胞成骨分化。

小鼠胚胎腭间充质细胞的初级纤毛观察

目的：观察体外培养的小鼠胚胎腭间充质细胞上是否存在初级纤毛,并探讨是否能通过血清饥饿影响间充质细胞初级纤毛数量。方法：荧光标记体外培养的小鼠胚胎腭间充质细胞,观察该细胞上是否存在初级纤毛,再对培养细胞进行血清饥饿,计数血清饥饿前后小鼠胚胎腭间充质细胞中有纤毛的细胞数量所占比例。结果：体外培养的小鼠胚胎腭间充质细胞上观察到荧光标记的初级纤毛,但有纤毛的细胞占总细胞数量比例〈1%,而血清饥饿后纤毛细胞占总细胞的数量比例提高至4%。结论：体外培养的小鼠胚胎腭间充质细胞上存在初级纤毛,血清饥饿可以提高该细胞中有纤毛细胞的比例。

叶酸对小鼠腭突间充质细胞增殖的影响

目的:从细胞水平对维A酸致小鼠腭裂畸形作用和叶酸是否有拮抗维A酸的致畸作用及其机制进行研究。方法:给予孕鼠过量维A酸,诱导胚胎腭裂模型,不完全消化法提取孕期第14天、17天(GD14、17)的胚胎腭突间充质细胞(EPMcells)进行培养并鉴定细胞;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测加入不同浓度叶酸与未加入叶酸细胞增殖的情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学处理。结果:①在GD10、GD12管饲孕鼠50mg/kg维A酸,可致胎鼠腭裂畸形;②不完全消化法提纯EPM细胞,纯度达到98%;③维A酸导致GD14的EPM细胞增殖受到抑制,20μg/mL、40μg/mL浓度叶酸可拮抗这种抑制作用。结论:①过量维A酸可致小鼠腭裂畸形,腭突间充质细胞增殖受抑制是其致畸机制之一;②叶酸可拮抗维A酸对小鼠GD14EPM细胞增殖的抑制作用。

全反式维甲酸通过γ-氨基丁酸途径促进小鼠胚胎腭板间充质细胞的凋亡(英文)

维甲酸(RA)是一种能够诱导腭裂发生的致畸物.研究显示γ-氨基丁酸(GABA)在腭板的发育过程中发挥重要作用.而GABA是否参与了RA诱导的腭裂发生还不清楚.本研究以小鼠胚胎腭板间充质细胞(MEPM)为研究对象,观察全反式维甲酸(atRA)(0.2、0.67、2.0和6.7μmol/L)对MEPM细胞增殖和凋亡的影响,并探讨GABA信号通路在其中的可能作用.结果显示,atRA(2.0μmol/L和6.7μmol/L)显著性抑制了MEPM的增殖,并促进了细胞凋亡.atRA(0.67、2.0和6.7μmol/L)显著性降低了GABA合成的关键酶谷氨酸脱羧酶(GAD67)mRNA和蛋白质的表达,但对γ-氨基丁酸A型受体-β3(GABAAR-β3)mRNA和蛋白质的表达没有影响.1.0μmol/L的GABA逆转了atRA(6.7μmol/L)对MEPM细胞增殖和凋亡的影响.以上结果表明,atRA通过下调GAD67的表达,减少GABA的产生,抑制MEPM的增殖和促进MEPM的凋亡,从而可能影响腭板的发育,诱导腭裂形成.

地塞米松对A系小鼠胚腭突间充质细胞表皮生长因子基因表达的影响

目的:研究地塞米松(DEX)对A系小鼠胚腭突间充质细胞表皮生长因子(EGF)基因mRNA表达的影响。方法：将DEX(10ng/ml)加入培养的A系小鼠胚腭突间充质细胞，并在培养第1、3、5天时收集细胞，提取RNA，应用RT-PCR技术半定量检测腭突问充质细胞EGF基因mRNA的表达水平。结果：DEX可显著促进腭突间充质细胞EGF mRNA的表达，并在加入DEX培养第3天时，这种促进EGF mRNA表达的作用最强。结论：DEX显著促进腭突间充质细胞EGF基因的表达，可能干扰腭突间充质细胞EGF基因的表达而影响了腭发育。

地塞米松对A系小鼠胚腭突间充质细胞增殖代谢的影响

目的 研究不同剂量地塞米松(DEX)对A系小鼠胚腭突间充质细胞增殖和DNA、蛋白质及PGE2 合成的影响。方法 实验分为9组,每组设平行4孔(瓶) ,每组分别加入DEX使其终浓度为0 .0 5ng/ml,0 .1ng/ml,0 .5ng/ml,1ng/ml,5ng/ml,1 0ng/ml,5 0ng/ml,1 0 0ng/ml,1 0 0 0ng/ml,每组均设空白对照,在实验后第1、3、5天分别检测细胞的OD值及PGE2 的含量,并在第3天时检测DNA、蛋白质的含量。结果 DEX可显著增加腭突间充质细胞的OD值,促进DNA及蛋白质合成,在含量0 .5ng/ml时DEX的促进生长作用最强。在培养早期DEX轻度降低腭突间充质细胞PGE2 的合成,而在培养后期则表现为显著抑制作用。结论 DEX显著促进腭突间充质细胞的增殖代谢,可能干扰腭突间充质细胞的正常生长代谢而影响了腭发育。

TCDD对小鼠腭突间充质细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨2,3,7,8-四氯二苯并对二噁英(TCDD)对小鼠腭突间充质细胞增殖和凋亡的影响。方法:采用随机数字表法将SPF级C57BL/6N孕鼠分为TCDD组和对照组,在妊娠第10天(GD10)分别以64μg/kgTCDD和等量玉米油灌胃,取GD13、GD14、GD15胚胎头部,行组织形态学观察。收集GD13正常胎鼠腭组织,分离腭突间充质细胞,用0.0、0.1、1.0、10.0nmol/LTCDD处理72h后,采用MTT法检测细胞增殖并计算增殖抑制率,检测Brdu阳性率,采用荧光定量RT-PCR和Westernblot法检测细胞中PCNA、Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达水平。结果:组织形态学显示TCDD组胎鼠双侧腭突未接触和融合。随着TCDD作用浓度的增加,小鼠腭突间充质细胞增殖抑制率逐渐增加,Brdu阳性率逐渐降低,细胞中Bax、Caspase-3mRNA和蛋白表达逐渐增加,而PCNAmRNA和蛋白表达逐渐降低(P<0.05)。结论:TCDD可能通过抑制腭突间充质细胞的增殖并促进其凋亡,导致腭裂的发生。

ARHGAP29调控小鼠腭突间充质细胞增殖能力的研究

目的:探讨ARHGAP29对小鼠腭突间充质细胞增殖能力的影响。方法:免疫组织化学染色确定ARHGAP29在腭突组织中的表达;体外培养GD13.5小鼠腭突间充质细胞,免疫荧光染色鉴定细胞来源;合成3条Arhgap29基因特异性小干扰RNA进行体外沉默实验,利用Real-time PCR和Western blot检测沉默效率;CCK-8法检测Arhgap29基因沉默后腭突间充质细胞增殖能力的改变;实验结果采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计学分析。结果:免疫组织化学结果示ARHGAP29在GD13.5小鼠腭突组织中显著表达;免疫荧光染色结果显示Vimentin染色的腭突间充质细胞包浆着色,绿色荧光表达强,Cytokeratin染色的细胞未见有阳性表达;Real-time PCR和Western blot结果显示,相较于阴性对照组和空白对照组,实验组ARHGAP29 mRNA和蛋白表达水平明显降低,其中Arhgap29-siRNA3的沉默效果最好(P<0.001);CCK-8结果显示体外沉默Arhgap29基因48 h后腭突间充质细胞的增殖能力开始上升,转染72 h细胞的增殖能力显著增强(P<0.05)。结论:ARHGAP29可能通过促进腭突间充质细胞的增殖,在腭突发育阶段造成腭突与口腔上皮的黏连,从而影响腭部的正常发育。

TG-相互作用因子在维甲酸抑制腭突间充质细胞增殖过程中的作用

目的:探索TG-相互作用因子(TGIF)在维甲酸抑制腭突间充质细胞增殖过程中作用。方法:分离、培养妊娠13 d胎鼠腭突间充质细胞。MTT实验检测0~10.0μmol/L全反式维甲酸(atRA)在不同时间点对胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响。Western blot检测对照组、5.0μmol/L atRA处理组细胞内TGIF蛋白的表达。TGIF siRNA和control siRNA分别转染胎鼠腭突间充质细胞,并设置空白对照组,Western blot检测TGIF siRNA转染胎鼠腭突间充质细胞后的基因沉默的效果;MTT实验检测TGIF siRNA转染后atRA对胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响。结果:0.1~10.0μmol/L的atRA对不同时间点胎鼠腭突间充质细胞的生长均有抑制作用,呈时间-剂量依赖性;且在72 h时,5.0和10.0μmol/L的atRA对胎鼠腭突间充质细胞的增殖具有明显的抑制作用(P<0.05)。TGIF siRNA转染后,5.0μmol/L atRA对胎鼠腭突间充质细胞增殖的抑制作用不明显(P>0.05)。结论:atRA对腭突间充质细胞增殖的抑制作用可能主要通过TGIF介导。

腭突间充质细胞中TGFβ1信号通路介导维甲酸致腭裂的实验研究

目的探讨转化生长因子β1(TGFβ1)信号通路在维甲酸(RA)致腭裂过程中的作用。方法选取8~10周龄野生型小鼠,构建RA诱导腭裂的小鼠模型,分别取E13.5(E13.5组)、E15.5(E15.5组)和E17.5(E17.5组)的腭突,荧光定量PCR(q-PCR)检测TGFβ1基因的表达,信号通路检测法(Western blot)检测下游p-Smad2(S467)的表达;RA处理原代培养的腭突间充质细胞(MEPM),q-PCR检测TGFβ1基因的表达,Western blot检测下游p-Smad2(S467)的表达。RA和TGFβ1共同处理MEPM,CCK-8法检测细胞的增殖活性。结果 RA诱导的腭裂小鼠中,E13.5组和E15.5组腭突中TGFβ1的表达显著下降(P<0.01),到E17.5时,与对照组的表达水平相当(P>0.05)。p-Smad2(S467)的表达也呈现同样的趋势。RA显著抑制了MEPM中TGFβ1和p-Smad2(S467)的表达,且呈浓度依赖性。RA和TGFβ1共处理组的细胞增殖活性较RA单纯处理组显著上升,体外添加TGFβ1重组蛋白能有效逆转RA对MEPM增殖的抑制作用。结论 MEPM中TGFβ1信号通路在RA致腭裂过程中发挥着重要作用。

地塞米松对小鼠腭突细胞增殖和分布的影响

目的:通过比较不同时期正常胎鼠和地塞米松诱导的腭裂胎鼠中间嵴上皮细胞(MEE)和腭突间充质细胞(EPM)的数目和分布情况,初步探讨腭裂形成的机制。方法:选取孕鼠30只,随机分为对照组和实验组,实验组于妊娠GD11.5腹腔内注射50mg/kg地塞米松,干扰胎鼠腭突发育,分别于GD12.5,13.5,14.5,15.5,16.5时取材,共获胚胎284只,取头部标本做冠状切片,切片厚6μm,HE染色,光镜下观察,记录MEE细胞的数量和EPM细胞的数目和分布情况。结果:实验组和对照组腭突突部EPM明显多于根部,且实验组EPM发育滞后于对照组;GD13.5,14.5,15.5时实验组EPM细胞数量少于对照组;实验组MEE细胞在GD15.5,16.5时大量存在,而对照组GD14.5时开始融合甚至消失。结论:地塞米松导致的EPM细胞增殖抑制和MEE细胞的转归异常,是腭裂形成的重要原因。

Meg3在全反式视黄酸诱发小鼠腭裂中的作用

目的:探索母系印迹基因3(Meg3)在全反式视黄酸(atRA)诱发腭裂中的作用。方法:妊娠第10天(GD10),将90只孕鼠随机分为atRA组和对照组(每组45只),分别给予100 mg/kg atRA和等体积的玉米油灌胃。HE染色观察GD13、GD14、GD15胎鼠腭部发育情况,BrdU荧光染色观察GD13、GD14、GD15胎鼠腭突间充质细胞增殖情况。在GD14,荧光原位杂交和实时荧光定量PCR法检测两组胎鼠腭突间充质细胞中Meg3的定位和表达,蛋白印迹法检测Smad通路相关蛋白磷酸化Smad2(p-Smad2)、Smad2、Smad4和Smad7的表达,RNA结合蛋白免疫沉淀实验检测Meg3基因与Smad2蛋白结合情况。结果:Meg3基因主要定位于胎鼠腭突间充质细胞的细胞核。与对照组相比,在GD14,atRA组细胞中Meg3 mRNA表达量升高(P<0.001),p-Smad2和Smad4蛋白表达水平降低(P<0.05),而Smad7蛋白表达水平增加(P<0.001);两组细胞中Meg3基因均可与Smad2蛋白结合,Meg3 mRNA相对表达量atRA组大于对照组(P<0.001)。结论:atRA可能通过促进Meg3与Smad2的结合,影响TGF-β/Smad信号通路的激活,抑制胎鼠腭突间充质细胞的增殖,从而导致腭裂的发生。

小鼠胚胎腭突间充质细胞体外培养及生物学特性研究

目的 研究小鼠胚胎腭突间充质 (EPM)细胞的生物学特性。方法 在显微镜下解剖妊娠第 13天的母鼠胚胎腭突 ,用 0 .2 5 %胰蛋白酶进行消化获得游离分散的EPM细胞 ,在含 10 %胎牛血清的DMEM培养基中进行培养。采用免疫组化方法进行细胞鉴定 ,通过相差显微镜 ,生长曲线及透射显微镜观察细胞形态 ,增殖能力及超微结构。结果 EPM细胞为成纤维细胞样细胞 ,排列无序 ,细胞核大 ,核分裂象多 ,核膜内陷 ,核呈分叶状 ,胞浆含大量线粒体及粗面内质网。免疫组化显示角蛋白标记为阴性 ,S -10 0蛋白及波形蛋白标记为阳性。EPM细胞呈指数生长 ,有较强的增殖能力。结论 EPM细胞体外培养生长及增殖良好 ,可作为腭裂基础研究较理想的研究对象。