腮腺炎病毒分离株(SP株)SH基因及其旁侧序列的初步分析

目的比较腮腺炎病毒分离株SP株与其他野毒株的序列差异,以确定其遗传特征。方法将2005年在云南省石屏县收集到的腮腺炎患儿唾液标本,于Vero细胞培养7 d后观察病变并分离收获病毒,用血细胞吸附试验验证。同时提取病毒RNA,采用反转录-套式聚合酶链反应(RT-nPCR)法从病毒RNA中扩增出SH基因及其旁侧序列,测序并以VectorNT16．0软件分析。结果SH基因旁侧区序列分析表明:SP株与国内已知野毒株具有明显的亲缘关系,在SH基因旁侧区范围内的序列一致性为93％～96％,差异均＜8％。氨基酸序列分析发现:该毒株与其他国内野毒株在此区域中的氨基酸序列一致性为93．3％～98．25％,与Wlz2株的遗传距离最近。结论SP株属于F基因亚型。

不同代次F基因型SP-A株腮腺炎病毒在恒河猴体内的致病性

目的观察不同代次F基因型SP-A株腮腺炎病毒在恒河猴体内的致病性。方法选取腮腺炎病毒SP-A株在KMB17细胞上传至15、20、30代的活病毒作为实验组,在Vero细胞上传至第2代的病毒作为野毒株对照组,分别接种恒河猴腮腺。观察实验动物体温和临床体征。活体取双侧腮腺,进行组织病理检查,并检测腮腺炎病毒中和抗体。结果对照组动物出现了明显的体温升高,一般状况较差,注射后第5天出现腮腺肿大,组织病理检查表现为淋巴细胞大量浸润。而各实验组动物均未出现腮腺炎症状和明显的组织病理学变化。各组动物接种病毒后均能产生抗腮腺炎病毒的中和抗体,但对照组的中和抗体GMT水平均高于各实验组。结论腮腺炎病毒SP-A株传至第15代次,已无致腮腺炎发病能力,为开发F基因型腮腺炎病毒减毒活疫苗奠定了基础。

新型鹅细小病毒徐州分离株NGPV XZ-01的分离和致病性研究

为了研究2021年6月江苏徐州某商品半番鸭养殖场所发疾病的病原及其致病性,从该养殖场发病的半番鸭群中无菌采集肝脏、脾脏、肠道等临床样品,采用PCR方法对病原进行鉴定,将所采集样本处理后接种至非免疫鸭胚中,连续多次传代后,对鸭胚组织及尿囊液进行病理学、电镜检查及动物试验。结果显示:PCR检测结果鉴定为新型鹅细小病毒阳性;鸭胚尿囊液在电镜下观察到细小病毒粒子,胚体病理切片观察显示符合细小病毒所致病变;动物试验显示,攻毒试验鸭主要表现为生长发育明显受阻,大部分试验鸭成为“僵鸭”,于20日龄后陆续出现上下喙变短、舌头外露等症状,剖检病变主要为肠内容物稀薄及泄殖腔膨大,肠道组织切片观察显示肠绒毛上皮细胞坏死、脱落及部分肠腺坏死,符合鸭短喙侏儒综合征(short beak and dwarfism syndrome,SBDS)所致雏鸭的症状与病变。结果表明:该肉鸭养殖场所发疾病为SBDS,将该场分离的病毒命名为新型鹅细小病毒徐州分离株(NGPV XZ-01株)。

新型鹅细小病毒徐州分离株(NGPV XZ-01株)对半番鸭生长发育的影响

为了探究新型鹅细小病毒徐州分离株(NGPV XZ-01株)对半番鸭生长发育的影响,试验将180只健康非免疫半番鸭随机分为3组,分别为对照组、3日龄攻毒组和7日龄攻毒组,每组60只,对照组于3日龄时皮下注射灭菌生理盐水0.2 mL,3日龄攻毒组和7日龄攻毒组分别于3日龄和7日龄时皮下注射NGPV XZ-01株病毒液(第7代,效价为5.7 lgELD_(50)/mL)0.2 mL,攻毒后观察并记录各组的生长发育情况、临床症状、发病和死亡情况,并对喙长和体重进行测定,于25日龄时全部扑杀,进行剖检、病理切片观察和X光检查。结果表明:攻毒后,3日龄攻毒组和7日龄攻毒组均生长发育迟缓或成僵鸭;24日龄时,3日龄攻毒组和7日龄攻毒组的体型明显小于对照组,3日龄攻毒组体型明显小于7日龄攻毒组。试验期间,3日龄攻毒组和7日龄攻毒组表现为精神萎靡不振、喜卧、打堆、排白色或黄白色粪便,部分患鸭出现运动障碍、瘫痪等症状;随着日龄的增长,上下喙变短及舌头外露的症状逐渐明显。其中3日龄攻毒组发病率为90.0%、死亡率为11.7%;7日龄攻毒组发病率为76.7%、死亡率为6.7%;对照组无发病和死亡情况。10~22日龄时,3日龄攻毒组和7日龄攻毒组的体重和喙长均显著低于对照组(P<0.05),3日龄攻毒组的体重和喙长均显著低于7日龄攻毒组(P<0.05)。3日龄攻毒组和7日龄攻毒组剖检可见泄殖腔膨大,肠道内容物稀薄,肝脏均出现水肿、质脆等病变;病理切片观察可见十二指肠肠绒毛顶端上皮细胞坏死,十二指肠绒毛不同程度脱落,部分肠腺坏死;部分肝细胞出现坏死,肝窦淤血,有炎性细胞浸润;其他脏器未见明显病变。对照组未见明显异常。X光检查可见3日龄攻毒组和7日龄攻毒组下喙、翅、腿等部位明显小于对照组,且胫骨长度远低于对照组。说明NGPV XZ-01株可使半番鸭的生长发育明显受阻,具有很强的致病性,且对半番鸭的影响随感染日龄的增加而减小。

我国马流感病毒不同分离株实验感染SPF鸡的研究

本试验分别用马流感病毒吉林株、青海株和北京株人工感染ＳＰＦ鸡，通过ＨＩ价测定、临床观察，病毒分离以及病理观察，证明马流感病毒可在ＳＰＦ鸡体内激发短期的免疫应答，在各实质器官引起轻微的损害，但无明显临床症状，病毒分离阴性。

流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84六代次基因序列分析

目的分析6个代次流行性腮腺炎病毒疫苗株WM84融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)和疏水蛋白(SH)的基因序列,并与Jery-Lynn(JL)株和ME株进行比较。方法WM84株病毒在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代至12代,观察各代病毒的培养特性,测定2、7、9、10、11、12代主要结构蛋白基因及高变区SH基因序列,与GenBank中参考毒株JL2、JL5和ME株进行比对,分析其核苷酸序列及相应氨基酸序列的差异,并构建系统进化树。结果WM84株病毒在CEF上连续传代至12代,其培养特性及病毒滴度基本稳定。与WM84株2代相比,其各代在主要蛋白基因区域有散在的核苷酸变化。7～12代病毒HN、F和SH基因与2代相比,核苷酸同源性分别为97.0%～100%、97.0%～100%及94.0%～100%;氨基酸同源性分别为98.3%～100%、97.2%～100%及94.1%～100%。2～7代病毒,HN、F和SH基因氨基酸与JL2株同源性为98.8%～99.5%,与JL5株同源性为94.1%～98.3%,传至11、12代,与JL5株同源性达99.8%～100%。结论WM84株2～7代病毒蛋白基因与JL2株十分相似,但在后续传代过程中出现了JL2株向JL5株转化的倾向。WM84株病毒在传代过程中HN及F基因结构基本稳定。

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0708株的分离鉴定及其Nsp2基因的遗传变异分析

采集江西省某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,RT-PCR检测可扩增出PRRSV ORF7特异性片段,序列分析发现其与美洲型毒株序列一致性达93.9%以上,与欧洲型毒株仅为69.8%。将采集的脑和肺脏处理后接种Marc-145细胞盲传,在盲传的细胞中可扩增到PRRSV ORF7特异性片段,传至第6代时出现明显的细胞病变;将该毒株NSP2非结构蛋白基因测序分析,发现其编码的氨基酸与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株有较高的同源性,与美洲型代表株VR-2332相比缺失第482位和533-561位共30个氨基酸;纯化病毒并进行电镜观察,可见典型的PRRSV病毒粒子。第8代的细胞毒回归30日龄仔猪,可观察到猪繁殖与呼吸综合征典型症状和病理变化。这表明已成功地分离到1株美洲型PRRSV变异株,命名为JX0708株。

基于SH片段的中国腮腺炎病毒疫苗株与野毒株鉴别方法的建立

目的研究建立一种简便快速的鉴别中国腮腺炎病毒疫苗株与野毒株方法。方法在已扩增出的小疏水蛋白基因(small hydrophobic gene)(SH基因)上,寻找能将中国腮腺炎病毒疫苗株区别于野毒株的限制性内切酶酶切位点,并对逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的方法进行特异性实验证明。结果非腮腺病毒RT-PCR结果均未见阳性条带,说明RT-PCR方法特异。PCR产物经BclI酶切作用后,腮腺炎野毒株将会被酶切为170bp和340bp两个片段,而疫苗株则被酶切为270bp和240bp两个片段。结论新建立的RT-PCR-RFLP是一种快速、简便的鉴别中国腮腺炎病毒疫苗株与野毒株的方法。

猪伪狂犬病病毒BJC变异株分离鉴定及gB和gE基因序列分析

为了确定伪狂犬病疑似发病猪场PRV变异株病原及其病毒分子特征,通过病理剖检、病毒分离鉴定与纯化、ST细胞TCID_(50)和小鼠LD_(50)测定,对分离鉴定的病毒gB、gE基因进行PCR扩增、回收、克隆和测序,用生物信息学分析软件Geneious Prime对gB、gE基因进行遗传进化和同源性分析。结果显示,该分离株为PRV强毒株。该病毒在ST细胞生长良好,纯化后的病毒经测定半数组织培养感染量为10^(8.5)TCID_(50)/mL,对6周龄昆明小鼠的LD_(50)为10^(5.8)TCID_(50)。测序结果与预期的PRV gB、gE基因片段相符。遗传进化分析可知与国内代表PRV变异毒株如JS2012、HN1201、ZJ01等处于同一分支,与欧美分离株如Bartha、Kaplan、Becker等亲缘关系较远,处于不同的大分支。氨基酸序列分析表明,BJC株与国外经典毒株和国内早期分离毒株存在多个特征性位点替换,符合国内流行变异毒株特征,BJC株为PRV变异毒株。

一株猪流行性腹泻病毒变异株的分离、鉴定与全基因组序列分析

江苏省某猪场疑似发生猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED),采集病料后,经RT-PCR检测PEDV呈阳性。病毒感染Vero细胞能够引起明显的细胞病变,间接免疫荧光鉴定结果显示病毒感染细胞后能被抗PEDV N蛋白的特异性单克隆抗体识别。通过全基因组序列分析,鉴定该毒株为PEDV G2b亚型变异株,并将其命名为PEDV JS-B株。

鹅细小病毒强毒株的分离鉴定与遗传进化分析

为了了解齐齐哈尔地区鹅细小病毒(GPV)现地强毒株的流行及抗原变异情况,试验从齐齐哈尔龙江县某养殖场采集疑似小鹅瘟病死雏鹅的肝脾病料进行病毒分离培养,对获得的疑似尿囊液进行PCR检测、血凝性检测、动物回归试验及VP3基因序列分析。结果表明,分离到的病毒株能使12日龄鹅胚在144 h内死亡;血凝性检测未检测出血凝价;动物回归试验,可复制该病,致使5日龄雏鹅在96~144 h内全部死亡;VP3基因PCR扩增条带大约为1 600 bp,与目的条带大小相符;对其进行序列分析,判定该分离株为鹅细小病毒毒株,与我室之前分离鉴定的鹅细小病毒HH10强毒株核苷酸同源性为98.17%,与标准B株核苷酸同源性为97.13%。说明鹅细小病毒基因保守。

天津地区猪伪狂犬病毒变异株的分离鉴定及主要相关毒力基因分析

为了鉴定猪伪狂犬病病毒(PRV)流行株及其携带毒力基因的变异情况,本研究采集1份天津地区某猪场免疫过Bartha-K61疫苗但患严重神经症状的仔猪脑组织样品,采用荧光定量PCR(q PCR)检测PRV g E基因,并将检测为PRV的阳性样品接种PK-15细胞分离培养,并传3代后采用Reed-Muench法测定分离病毒的TCID_(50),采用q PCR和间接免疫荧光试验(IFA)进一步鉴定分离病毒。结果显示,经q PCR检测仔猪脑组织样品出现扩增曲线,阳性样品分离培养后测得病毒滴度为10^(7.57)TCID_(50)/m L,分离病毒的q PCR结果出现扩增曲线,且其感染的细胞出现绿色荧光。表明分离到一株PRV,命名为TJbd2023株。采用PCR分别扩增TJbd2023株主要相关毒力基因g B、g C、g D、g E、g G、g I和TK,采用Meg Align软件分析分离病毒与Gen Bank登录的PRV参考株上述各毒力相关基因序列的同源性,通过Neighbor-Joining(NJ)法构建上述各毒力相关基因的进化树,采用Meg Align软件分析各毒力基因编码氨基酸主要位点的变异情况。结果显示,分别扩增到TJbd2023株的各相应毒力基因;各毒力基因的同源性分析结果显示,TJbd2023株与国内2012年后流行变异株的相似性高达98.4%~100.0%,与疫苗株(Bartha-K61)的相似性为89.6%~93.2%。进化树结果显示,这7个毒力基因均与国内GD0304株(MH582511)、BJYT株(KC981239)和DL1408株(KU360259)等PRV变异株位于同一分支,与疫苗株(Bartha-K61)未在同一分支。g B、g C、g E氨基酸序列除出现PRV变异株相同的突变位点外,g B还出现R^(223)H和E^(836)K的突变、g D出现R^(320)S和g E出现T^(242)A的突变。将TJbd2023株分别以5个剂量(10^(2.57)TCID_(50)/m L~10^(6.57)TCID_(50)/m L)感染6周龄KM小鼠,通过小鼠的临床症状、死亡率、死亡小鼠各组织的病理变化评估该病毒的致病性。结果显示,在5 d的观察期内,感染组小鼠陆续出现奇痒及神经症状,各实验组小鼠的死亡率分别为60%、80%、100%及100%,对照组小鼠均健活。死亡小鼠各组织病变观察可见肺组织浸润性出血、肝组织血管充血及淋巴细胞增多、脑胶质细胞增多及血管周围炎性细胞聚集形成血管套等病变,对照组小鼠各组织均无明显病变。上述结果表明,本研究在天津地区分离到一株PRV变异株,其毒力因子发生了独特的氨基酸位点突变,对小鼠的致病性较强,该结果丰富了PRV的致病性及其毒力因子变异的特征,为PR的综合防控提供参考。

腮腺炎病毒疫苗株与野毒株基因鉴别的研究进展

腮腺炎病毒的分子生物学特性已基本清楚。接种腮腺炎减毒活疫苗后的主要问题是Ｕｒａｂｅ株疫苗可引起脑膜炎，故许多国家已改用ＪｅｒｙｌＬｙｎｎ株疫苗。鉴别不同病毒株的可靠方法是分析比较病毒基因组中某些基因区域的核苷酸序列，此法有助于腮腺炎疫苗质量的监控及腮腺炎病毒分子流行病学研究。

11株猪繁殖与呼吸综合征病毒中国分离株NSP2、ORF5、ORF7基因的序列分析

2008年1月至2012年12月在中国进行的猪繁殖与呼吸综合征的跟踪调查中,从辽宁、吉林、河北、山东、河南、上海、浙江和广西8个省收集到的病料中分离到11株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分离株,分别扩增、克隆及用RT-PCR检测这11株猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株的NSP2、ORF5和ORF7基因的全序列,然后与其他分离株的已登录序列进行比对。结果表明,所有分离株的基因分型均属于美国株,但是与JXA1同源性很高,高致病性毒株为中国所特有。11株分离株均在NSP2基因含有90个核苷酸的缺失,这表明2008年流行的PRRSV为该基因缺失分离株。在这11株分离株的ORF5和ORF7基因的特定区域发现更多一致的突变,如GP5的信号肽和跨膜区及N蛋白的Pat7修饰区。这些突变是否影响PRRSV的核定位,还有待于进一步的研究来验证。

鹅副粘病毒分离株生物学特性的研究

鹅副粘病毒病是一种新发现的由副粘病毒引起的能引起不同年龄鹅发病、以消化系统损害为主的传染病。本研究对一野毒株 (NA_1)应用鸡胚传代、电镜形态学观察、红细胞凝集_红细胞凝集抑制试验、鹅体回归试验、实验免疫保护试验等进行了研究 ,并进行了三项毒力指标的测定。依据国际上判定新城疫病毒毒力的标准 ,NA_1毒株均具有与新城疫病毒速发型相似的毒力 ,属于强毒力的毒株。应用NA_1毒株制备的油乳剂灭活苗实验免疫雏鹅 。

猪流感病毒广东株的分离鉴定及其特性

对广东省 2 5个猪场有呼吸道症状的 30～ 6 0日龄仔猪 ,用棉拭子采样 ,接种鸡胚分离病毒。经鉴定 ,7株为H1N1亚型毒株。对其中 3株分离株的形态学、部分理化特性和生物学特性的研究结果表明 ,病毒粒子在透射电镜下为杆状、丝状、椭圆形及圆形 ,大小为 80～ 12 0nm ;血凝素(HA)均为热不稳定型 ;均不耐热且对乙醚、氯仿敏感 ;均能凝集公鸡、豚鼠、兔、大白鼠、山羊等动物红细胞 ,对小白鼠红细胞的凝集性有所不同 ,均不凝集牛和猪红细胞 ;经绒毛尿囊腔接种 9日龄鸡胚 ,不能导致鸡胚死亡 ,EID50 分别为 10 — 6 .17/ 0 .2mL、10 - 5.83/ 0 .2mL、10 - 4.4 3/ 0 .2mL ;经鼻腔途径感染小白鼠 ,均未导致小鼠出现症状和死亡 ,接种后第 14d在部分存活的小鼠血清中可检出病毒抗体。

I群禽腺病毒江苏分离株(FAVI-JS)的分离鉴定

通过形态学、致细胞病变和序列比较等对一株疑为I群禽腺病毒江苏分离株FAVI_JS进行了鉴定 ,试验结果表明 :该病毒为球形、无囊膜、二十面体对称 ,直径为 70nm～ 80nm ;不具有凝集鸡、鸭、鹅红细胞的能力但可以凝集大鼠红细胞。在鸡胚肾细胞 (CEK)上可致细胞变圆 ,折光性增强等病变 ;通过PCR方法扩增出的FAVI_JSL、R、ITR三个片段 ,经过测序分析并与GenBank上发表的属于血清I型的CELO病毒、FAV_1、FAV_A和血清 8型的禽腺病毒 (FAV_8)全基因组的相应序列比较 ,FAVI_JS与I群禽腺病毒各毒株在三个片段上同源性都很高 ,其中与血清I型的同源性高达 96 %以上 ,在根据对遗传上具有重要意义的ITR序列绘制的遗传进行树分析 ,FAVI_JS与Ⅲ群禽腺病毒EDS、Y81G4株明显属于不同的分支 ,而与群禽腺病毒 ,特别是与血清I型的禽腺病毒更接近 ,这些结果证明 。

伪狂犬病病毒Guizhou-DY株的分离鉴定及致病性研究

通过采集疑似猪伪狂犬病流产胎儿病料，采用细胞接毒分离培养、病毒蚀斑纯化、病毒的形态结构观察、易感动物接种试验和病毒核酸鉴定分离到1株伪狂犬病病毒（PRV），命名为PRVGuizhou—DY株（GenBank登录号为JX417716）；为了摸清其理化特性，进一步对Guizhou—DY分离株进行了耐热、耐酸及脂溶性敏感性试验、核酸类型鉴定及病毒毒价测定，同时进行病毒致病性试验。分离鉴定结果表明：病料接种Vero细胞盲传至第2代时产生明显CPE，盲传至第4代可出现稳定的CPE；病毒粒子在电镜下呈椭圆形、有囊膜、直径为120～180nm，核内可见呈晶格状排列的病毒包涵体；病毒悬液接种家兔能引起家兔奇痒、麻痹死亡；理化特性研究表明：该病毒是一种耐热不耐酸且对氯仿敏感的DNA病毒，gE全基因序列与PRVGZ—Z1株、Fa株及Ea株的相似性分别为97．60A、98．9％和99．4％，其TCID50为10-9.71·100μL-1，PFu为109·mL-1. 攻毒组猪体温升高，临床症状较为明显，在攻毒后第5天开始出现中和抗体，第21天达到最高。该研究可为PRV病原学研究提供参考。

柯萨奇病毒A组16型中国分离株(Cox.A16 SHZH00-1)全基因组序列测定及分析

对分离自2000年中国深圳地区手足口病患儿粪便标本的柯萨奇病毒A组16型(CoxsackievirusA16,Cox.A16)病毒SHZH00-1株进行全基因组序列测定及分析后发现,Cox.A16SHZH00-1的基因组(未包括多聚腺苷酸尾)长度为7410bp,其中5′端非编码区(5′UTR)长为745bp,病毒基因组编码区全长6582个核苷酸,编码一个含2193个氨基酸残基的多聚蛋白,3′端非编码区长为83bp。Cox.A16SHZH00-1基因组的结构与Cox.A16亚洲地方株Tainan-5079-98(AF177911)十分相近,整个基因组的核苷酸同源性为97.5%,氨基酸同源性为98.8%;而与Cox.A16国际标准株G10(U05876)差别较大,两者核苷酸同源性仅为79.1%,氨基酸同源性为94.5%。Cox.A16SHZH00-1与两株肠道病毒71型SHZH03(AY465356)和BrCr(U22521)比较,核苷酸同源性均不超过80%。

犬细小病毒分离株VP2基因的克隆与序列分析

以犬细小病毒 (Canine parvovirus,CPV)扬州分离株病毒的 DNA为模板 ,根据基因库 CPV-d序列设计合成了VP2基因的 1对特异引物 ,进行聚合酶链式反应 ,扩增出约 1 .7kb的片段 ,按常规方法克隆进 p UC1 8载体 ,经 Eco R 和Sal 双酶切筛选到阳性质粒 ,进一步对该片段进行序列分析。结果表明 :所扩增基因片段长度为 1 740 bp,与美国参考株 CPV-d (type 2 )、CPV-1 5 (type 2 a)、CPV-3 9(type 2 b)相比较 ,核苷酸同源性分别高达 99.5 %、99.7%、99.7%。