牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。

牛病毒性腹泻病毒E^(rns)-ELISA抗体检测试剂盒的制备

为建立快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清学方法,本试验以BVDV NADL毒株结构蛋白E^(rns)作为包被抗原,优化反应条件并组装BVDV酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测试剂盒,通过重复性试验、灵敏性试验、符合率试验和保存期试验验证该试剂盒的准确性、灵敏性和稳定性。结果显示,抗原包被浓度为4μg/mL,1%酪蛋白溶液37℃封闭45 min,被检血清以1∶400稀释孵育30 min,兔抗牛HRP标记二抗以1∶20000稀释孵育30 min,TMB底物反应5 min时,ELISA的反应背景下降,区分度最好。优化后方法的批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均在10%以内,表明该试剂盒具有较好的稳定性;灵敏性试验结果显示,当阳性血清稀释度达到1∶6400时仍可以检测为阳性,说明该试剂盒灵敏度较高;该试剂盒与美国爱德士生物科技公司(IDEXX)BVDV总抗体检测试剂盒共同检测466份临床血清样品,两者总符合率为89.1%;保存期试验结果显示,第4个月时该试剂盒仍能检测到阳性血清,说明稳定性较好。综上表明,本试验利用E^(rns)蛋白建立的BVDV间接ELISA抗体检测试剂盒灵敏度高且重复性好,可为BVDV抗体检测和流行性调查提供新的方法。

河北省廊坊市牛主要病毒性腹泻病原感染状况检测及牛冠状病毒演化分析

牛病毒性腹泻病原严重危害畜牧业生产,BVDV、BoAstV、BCoV、MRV、BKoV、BoNeV、BNoV、BRV、BToV被认为是引起牛群腹泻的病原,不仅如此,BVDV、BCoV和BToV除了能引起消化道症状外还能引起呼吸道症状,BVDV不仅能引起消化道和呼吸道症状,还会导致母牛生殖功能异常,这些疾病对畜牧业造成巨大的经济损失。为了解牛主要病毒性腹泻病原流行情况,本次试验通过PCR检测方法对我国河北地区323份腹泻牛粪样品进行常见9种病毒性牛腹泻病原进行检测。结果显示,BVDV阳性检出率1.85%(6/323)、BCoV阳性检出率14.24%(46/323)、BRV阳性检出率57.89%(187/323)、BoAstV阳性检出率0.31%(1/323)、BoNeV阳性检出率10.84%(35/323)、BNoV阳性检出率4.33%(14/323)、MRV阳性检出率2.48%(8/323)、BToV阳性检出率4.64%(15/323)、BKoV阳性检出率11.76%(38/323)。混合感染共有76份,占比23.53%(76/323)。HBLF2302株的全基因序列、S、HE、N、M和E基因进行同源性和遗传进化分析发现,HBLF2302与BCoV/NMG1/2022基因同源性最高,为GIIb亚型。基于氨基酸序列比对和HBLF2302的S蛋白三级结构预测发现,在S蛋白中157号位突变为157T,854号位点突变为854I。318V为独特突变,改变了与侧链残基的作用力,与631C形成氢键连接。并发现中国株区别于其它地区的GⅡb亚型,位于ORF1a区域有三个独特位点。本研究丰富了牛腹泻病原的流行病学数据,为牛腹泻病的防控奠定基础。

猪病毒性腹泻有效防控——生猪产业无法回避的现实问题

猪病毒性腹泻并不是一种传染病,而是一大类感染消化道病毒病的统称,因其临床症状均导致腹泻而得来,其病源包括4种猪肠道冠状病毒和猪轮状病毒(PoRV)。猪肠道冠状病毒主要包括猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和新发的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)。

牛病毒性腹泻诊断与防治研究进展

近年来,牛病毒性腹泻在世界范围内广泛流行,给养牛业造成了严重的经济损失。该病严重损害牛群的免疫机能和繁殖机能,传播速度快,死亡率高。本文主要从诊断方法、防治措施等方面对该病进行综述,以期为牛病毒性腹泻的防治提供参考。

甘草锌联合布拉氏酵母菌散对轮状病毒性腹泻患儿心肌酶谱和免疫应答的影响

目的探讨甘草锌联合布拉氏酵母菌散对轮状病毒性腹泻患儿心肌酶谱和免疫应答的影响。方法选取2022年6月至2023年6月青海红十字医院收治的150例轮状病毒性腹泻患儿,根据随机数字表法分为对照组(n=75)、研究组(n=75)。对照组采用甘草锌联合双歧杆菌四联活菌片治疗,研究组采用甘草锌联合布拉氏酵母菌散治疗,比较两组的治疗总有效率、心肌酶谱、免疫应答指标。结果研究组治疗总有效率高于对照组(P<0.05);研究组治疗后的肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶水平均低于对照组(P<0.05);研究组治疗后的CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平均高于对照组,CD8^(+)水平低于对照组(P<0.05)。结论甘草锌联合布拉氏酵母菌散治疗轮状病毒性腹泻患儿可改善心肌酶谱,调节免疫应答,值得推广。

新疆某规模化肉牛场牛病毒性腹泻病毒分离与基因型鉴定

新疆许多规模化牛场存在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染,且因病毒基因型具有多样性,给该病的防控、疫苗选择、净化带来了一定的困难,开展新疆地区规模化牛场BVDV基因分型鉴定,对BVDV防控具有重要的指导作用。采集BVDV胶体金抗原检测卡确定为阳性的犊牛抗凝血样品并分离淋巴细胞,在MDBK单层细胞上进行病毒分离,盲传5代,提取培养物RNA,以BVDV5′-UTR、N^_(pro)特异性引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测分析。结果显示,获得BL分离株1株,属于BVDV-1m亚型,研究结果丰富了新疆南疆地区规模牛场BVDV分子流行病学数据库。

山东地区1株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解并掌握山东地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)流行毒株的生物学特性和遗传变异情况,为BVDV防控提供理论依据和技术支持。【方法】采集养牛场疑似BVDV感染样品制备组织上清液,利用RT-PCR方法进行病原鉴定,接种MDBK细胞进行病毒分离培养,采用间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察对分离毒株进行鉴定,对分离毒株全基因组进行分段扩增、克隆和测序,并采用Lasergene等软件分别对全基因组序列、N^(pro)和E2基因进行比对和遗传演化分析。【结果】病料样品BVDV特异性引物RT-PCR扩增得到大小约504 bp的目的条带,与预期大小一致。IFA结果显示特异性绿色荧光;电镜下可见直径约50 nm的病毒粒子,表明分离到1株非致细胞病变型BVDV毒株,命名为SDNF9株。分离株基因组全长为12232 nt,与BVDV参考毒株的全基因组核苷酸相似性为79.1%~93.8%,其中,与中国分离毒株22AH-1和澳大利亚毒株Bega-like的相似性最高,为93.8%;N^(pro)和E2蛋白氨基酸存在多个位点变异;SDNF9分离毒株与BVDV2型毒株和BVDV3型毒株处于遗传演化的不同分支,而与BVDV 1型毒株处于同一分支,属于BVDV 1c基因型。【结论】本研究成功分离到1株BVDV 1c流行毒株,并进行基因组和遗传演化分析,与中国分离毒株22AH-1亲缘关系最近,为山东地区牛病毒性腹泻的防控和疫苗研制提供数据和材料支持。

不同基因型牛病毒性腹泻病毒对BALB/c小鼠致病性研究

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602株BVDV感染BALB/c小鼠模型,通过检测攻毒后小鼠临床症状、体重变化、病毒血症情况、血液中白细胞与淋巴细胞的变化、组织器官的病理组织学变化及病毒载量,比较了分离株JS2201与1型和2型参考株的致病性差异。结果显示:BVDV分离株JS2201与参考株均能够成功感染BALB/c小鼠,攻毒BALB/c小鼠均形成病毒血症,导致血液中白细胞数量、淋巴细胞数量以及淋巴细胞百分比短暂下降;BVDV分离株JS2201株攻毒组小鼠肝脏、肾脏、肺脏、脾脏中BVDV载量要高于C24V、C1602株攻毒组;攻毒组小鼠均表现为间质性肺炎病变,JS2201株攻毒组与1型参考株C24V株攻毒组小鼠肺脏病理组织学变化相似,BVDV-2型参考株C1602株攻毒组小鼠肺脏病变更为严重。综上,本研究成功建立了不同亚型BVDV急性感染BALB/c小鼠的模型,且比较分析了分离株与参考株之间的致病性差异,为BVDV疫苗的研制以及致病机制的研究奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒诱导铁死亡对其复制水平的影响

本研究旨在探究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染对牛肾细胞(Madin-Darby Bovine Kidney cells,MDBK)铁死亡的调控作用及其对病毒复制的影响。本研究通过激光共聚焦、Western blot、qPCR和电镜技术等技术检测BVDV感染MDBK细胞铁死亡发生与病毒复制水平,另外,使用铁死亡抑制剂Fer-1研究铁死亡对病毒复制和细胞炎性因子表达的影响。结果表明:BVDV(MOI=5)感染细胞较正常对照组细胞死亡率显著增加(P<0.05),感染细胞内Fe 2+和脂质过氧化水平较正常细胞显著升高(P<0.05),透射电镜检测可见线粒体表面积变小、嵴减少以及膜密度增加等铁死亡发生特征;将铁死亡抑制剂Fer-1预处理MDBK细胞后,可显著抑制BVDV感染病毒复制水平(P<0.05);此外,BVDV感染诱导铁死亡对MDBK细胞中IL-1β、IL-18以及IFN-β等炎性因子呈正调控效应。以上结果提示,BVDV感染可引起宿主细胞铁死亡,且铁死亡发生可显著促进病毒复制水平以及宿主细胞炎性因子表达。

基于重组E2蛋白的牛病毒性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与评价

【目的】通过真核系统表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2蛋白,以此为包被蛋白建立一种BVDV间接ELISA抗体检测方法,以解决中国BVDV抗体检测技术不足的问题。【方法】将BVDV E 2基因克隆至真核表达载体pTT5,转染293F细胞,待50%细胞死亡后进行超声破碎,并使用Ni离子亲和层析的方法纯化重组E2(rE2)蛋白;以rE2蛋白作为包被抗原,通过对各反应条件进行优化后建立检测BVDV抗体的间接ELISA方法,进行敏感性、特异性、重复性评价,并与中和试验进行比对。用所建方法对不同省份的牛血清样本进行检测。【结果】采用293F细胞表达了rE2蛋白,经亲和层析方法纯化,rE2蛋白的纯度为99%,浓度为1.74 mg/mL;通过对各个反应条件优化,成功建立了BVDV间接ELISA抗体检测方法。该方法与商品化试剂盒的灵敏度一致,均可检出抗体效价临界血清(VN=1);具有良好的特异性,与传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒-3(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)和牛疱疹病毒-1(BHV-1)抗体阳性血清均无交叉反应;板内和板间重复性试验的变异系数均在5%以内,证明该方法重复性较好;与血清中和试验的符合率为97.5%。临床样本检测结果显示,共检测出364份阳性血清和64份阴性血清。【结论】基于真核表达的rE2蛋白所建立的BVDV间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性和敏感性,可用于BVDV抗体检测,本研究结果为中国牛病毒性腹泻防控工作提供一种有效的技术手段。

牛病毒性腹泻病毒陕西分离株的鉴定及E2基因的克隆与序列分析

为分析陕西省牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分子变异情况,采集陕西省某牛场腹泻患牛粪便样品,经处理后接种至MDBK细胞后,进行病毒分离鉴定并对分离的BVDV进行E2基因的克隆和遗传进化分析。结果显示,样品经过RT-PCR鉴定后接毒,第4天出现明显的细胞病变(CPE),通过设计特异性引物对收获的病毒成功扩增出BVDV E2基因,证明分离的病毒为BVDV。对该病毒的E2基因进行序列分析,所得序列与GenBank上已发表的BVDV毒株的核苷酸序列同源性为84.5%~100%,氨基酸序列同源性为82.1%~100%。结果表明,成功分离到牛病毒性腹泻病毒并进行了E2基因的克隆与序列分析,研究结果可为陕西地区BVDV的流行病学、致病性及生物学特性研究提供依据,为BVDV的区域流行及有效防控提供参考,为新疫苗的研发提供地方种毒。

牛病毒性腹泻病毒遗传多样性与防控研究进展

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea)是由黄病毒科瘟病毒属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染引起牛的一种传染病,在全球范围内广泛流行,导致严重的经济损失。BVDV可分为BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3基因型和众多的基因亚型,宿主范围比较广泛,而且可形成持续感染,抑制宿主固有免疫和适应性免疫应答,给防控带来困难。虽然在北欧一些国家利用监测淘汰实现了BVD净化,但在BVD流行率较高的地区,免疫控制策略现实可行。目前我国各地均有BVD报道,基于BVDV-1毒株的灭活疫苗已用于该病的防控,但用于预防多病原引起牛腹泻或牛呼吸道综合征的联合疫苗匮乏,多联多价疫苗的创制将有助于我国BVD防控和净化。

宿主蛋白Rab11a对牛病毒性腹泻病毒复制的影响

为了探索宿主蛋白Rab11a在感染牛病毒性腹泻病毒(BVDV)后,对细胞增殖的影响。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Rab11a基因稳定敲除的MDBK细胞株,设计靶向Rab11a基因的向导RNA表达载体,采用Western blot检测Rab11a基因敲除后的蛋白表达情况;使用实时荧光定量qPCR、免疫荧光染色试验、Reed-Muench法等技术检测BVDV感染Rab11a KO细胞后病毒RNA水平、双链RNA(dsRNA)积累水平、病毒滴度及致细胞病变(CPE)情况等。Western blot检测结果显示,成功构建出Rab11a基因敲除的细胞Rab11a KO;Rab11a基因敲除显著抑制BVDV 5'UTR mRNA和dsRNA水平的积累,感染36 h后,Scramble细胞明显有大量细胞病变,出现皱缩、碎裂、形成空泡后脱落等现象,Rab11a KO细胞的CPE现象明显低于Scramble细胞;在BVDV感染细胞12 h后,与Scramble细胞相比,Rab11a KO细胞的病毒滴度显著性降低,结果证明了敲除MDBK细胞的Rab11a基因对BVDV在胞内复制起到抑制作用。本研究结果为了解宿主蛋白Rab11a与BVDV的相互作用,以及Rab11a对病毒的复制增殖的作用提供了新的科学依据。

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p20的原核表达

牛病毒性腹泻是由黄病毒科、瘟病毒属中的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染牛引起的一种传染病,是一种全球性牛传染病。为了在原核表达系统表达BVDV非结构蛋白p20,并分离纯化蛋白进行晶体学研究。首先对BVDV-1 p20蛋白基因进行密码子优化,合成后克隆到pET30表达载体上。测序鉴定成功的pET30-p20表达质粒转化大肠埃希氏菌表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导获得的p20蛋白经过Ni柱、分子筛纯化。最终,经过多重缓冲溶液的筛选,p20蛋白可以稳定存在于含有5 mmol/Lβ-巯基乙醇、5%甘油、150 mmol/L氯化钠(pH8.0)的Tris-HCl缓冲液中。高纯度均一性的p20蛋白获得,为后续p20晶体学研究以及单克隆抗体的制备提供原核表达纯化方案。

牛病毒性腹泻病毒检测方法研究进展

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)对养牛业具有重大经济影响,而快速准确检测对于早期发现牛BVDV感染以便迅速采取针对性预防措施至关重要。常见的BVDV检测方法包括病毒分离鉴定、血清中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、环介导等温扩增(LAMP)等。本文分别从病原学、血清学和分子生物学检测方面,对多种BVDV检测方法研究进展进行综述,分析每种检测方法的优势和局限性,提出了在实际应用中应根据不同需求选用不同的方法或综合应用多种检测技术的建议,以期为建立更加快速、实用和准确的BVDV检测方法及其应用提供参考。

牛病毒性腹泻的发病趋势及综合防控

近年来,随着我国规模化、集约化养殖模式的发展壮大,牛病毒性腹泻在我国牛群养殖过程中发病率逐年攀升。目前,已经在我国大部分地区广泛流行,严重阻碍了养牛业的健康发展。为提高广大从业人员对这一疾病的认识,掌握该病科学的防控策略,降低牛病毒性腹泻对我国养牛业的危害,本文对牛病毒性腹泻的流行特点、临床症状、诊断方法及综合防治措施进行了具体分析阐述,以期能够为该病的防控和净化提供参考。

牛病毒性腹泻净化效果研究

为了解吉林省某规模牛场BVDV的流行情况,并制定净化方案,应用BVDV ELISA试剂盒对2022年3月—2023年10月采集吉林省某规模牛场的血液和粪便样本进行病原学调查。结果表明:该牛场全群BVDV抗体、抗原阳性率分别为2.72%、0.85%,抗原阳性5头(其中成年牛1头,后备牛1头,犊牛3头),抗体阳性16头(其中成年牛5头,后备牛5头,犊牛6头)。对检测为BVDV阳性的牛直接淘汰,并通过3次复检,筛选出BVDV持续性感染牛,对其进行淘汰,并对检测阴性牛免疫。经过长达1年的监测及淘汰,该规模牛场BVDV病原学检出率为0,取得了良好净化效果。

规模牛场牛病毒性腹泻-黏膜病流行病学调查

[目的]掌握病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD)在规模牛场3个品系牛间的感染状况,了解不同品系间BVDV感染是否存在差异。[方法]选择新疆师市范围内的19个规模牛场,分别饲喂中国荷斯坦奶牛(以下简称荷牛),弗莱维赫乳肉兼用牛×荷斯坦奶牛杂交代乳肉兼用牛(以下简称弗荷牛),挪威红牛×荷斯坦奶牛杂交代乳肉兼用牛(以下简称挪荷牛);共计采集血清样品7 965份,分别使用牛病毒性腹泻(BVD)实时荧光RT-PCR检测和牛病毒性腹泻ELISA方法检测抗原和抗体阳性率。[结果]实时荧光RT-PCR阳性总检出率为1.72%,荷牛阳性检出率为1.73%,弗荷牛阳性检出率为1.35%,挪荷牛阳性检出率为2.05%;场群阳性检出率为68.42%;3个品系的犊牛、青年牛、后备牛、成母牛均检测到BVDV,3个品系牛之间抗原阳性率差异不显著;牛病毒性腹泻ELISA方法检测阳性总检出率为36.69%,荷牛阳性检出率为37.11%,弗荷牛阳性检出率为36.74%,挪荷牛阳性检出率为34.02%,场群抗体阳性率为100%,3个品系牛之间抗体阳性率差异不显著。[结论]师市规模牛场3个品系牛均存在BVDV感染,且不同品系间BVDV感染率差异不显著。

1株进口胎牛血清源牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及小鼠致病性分析

【目的】对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)进行分离鉴定和遗传进化分析。【方法】通过RT-PCR方法检测到实验室购买的某进口胎牛血清中存在BVDV核酸污染,将污染血清接种MDBK细胞,传代培养至第7代,对每一代细胞的培养物进行BVDV 5′-UTR扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T载体并测序,对测序结果进行遗传进化分析;利用间接免疫荧光试验(IFA)进行分离株抗原检测和病毒滴度测定;将分离株接种BALB/c小鼠,采集眼眶血进行血常规检测和RT-PCR检测。【结果】该病毒分离株在培养MDBK细胞时未能引起细胞病变效应,细胞培养物RT-PCR扩增为阳性;基于5′-UTR序列的相似性分析表明,该分离株与BVDV UDEC-COY7-17(OL860952.1)毒株5′-UTR序列相似性为99.6%,同属BVDV-1e亚型;IFA检测到感染分离株的MDBK细胞细胞质中出现特异性绿色荧光信号,而对照组无信号;半数培养感染剂量(50%tissue culture infectivedose,TCID 50)为10-4.7/0.1 mL;接种BALB/c小鼠后第7天血常规检测其血液中白细胞(WBC)和淋巴细胞(LYM)数量极显著低于对照组(P<0.01)。提取血液总RNA进行5′-UTR RT-PCR检测,检测结果为阳性,扩增产物大小为298 bp,与预期相符。【结论】本研究在进口胎牛血清中分离得到1株非致细胞病变型BVDV-1e亚型毒株,证明进口胎牛血清中存在BVDV抗原污染,为进一步研究BVDV的相关分子机制提供试验材料。