3-吲哚丙酸抑制腹膜间皮细胞EMT和纤维化的机制研究

目的 评估3-吲哚丙酸(3-indoleacetic acid, IPA)对脂多糖(lipolyaccharide, LPS)诱导的小鼠腹膜间皮细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和纤维化的影响。方法 CCK-8法检测不同浓度(0.1、1.0和10μmol/L)的IPA对LPS处理前后的小鼠腹膜间皮细胞增殖活性的影响,确定IPA最佳使用剂量。将小鼠腹膜间皮细胞分成Control组、LPS组、LPS+IPA组、LPS+LY364947(TGF-β1/Smad3通路抑制剂)组、LPS+IPA+LY364947组和LPS+IPA+SRI-011381(TGF-β1/Smad3通路激活剂)组;CCK-8法检测细胞增殖活力,Transwell法检测细胞侵袭,ELISA检测培养上清中间质表型α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的浓度,Western blot检测细胞中α-SMA,EMT相关因子E-cadherin, TGF-β1/Smad3通路相关因子Smad3、p-Smad3的蛋白表达。结果 IPA的最佳使用剂量为1.0μmol/L。与Control组相比,LPS组细胞增殖活力、E-cadherin表达水平下降(均P<0.01),侵袭能力、α-SMA表达水平和p-Smad3/Smad3升高(均P<0.01)。与LPS组相比,LPS+IPA组和LPS+LY364947组细胞增殖活力、E-cadherin表达水平上升(均P<0.01),侵袭能力、α-SMA表达和p-Smad3/Smad3下降(均P<0.01)。与LPS+IPA组相比,LPS+IPA+LY364947组所测指标趋势更加显著,LPS+IPA+SRI-011381组所测指标变化趋势均被逆转。结论 IPA通过抑制TGF-β1/Smad3通路中Smad3蛋白的磷酸化,从而抑制细胞EMT进展,减轻LPS诱导的腹膜间皮细胞损伤。

猪腹膜间皮细胞的分离培养及初步应用

本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学、免疫学方法鉴定细胞。使用Mhr感染PMC细胞,观察细胞形态变化,并利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法检测细胞活性损伤情况。结果显示,倒置相差显微镜观察显示,分离培养的细胞早期呈拉网状,5~8 d后生长可达融合状态,细胞大小均一,呈多边形铺路石状;间接免疫荧光试验结果显示,细胞波形蛋白、角蛋白-18抗原呈阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原呈阴性;扫描电镜下可见细胞表面微绒毛。结果证实分离培养的细胞为猪PMC细胞,纯度达95%以上。Mhr感染后,光镜下可观察到细胞发生明显皱缩,感染组细胞的LDH释放量较对照组细胞显著升高。本研究成功建立了猪原代PMC细胞的分离培养方法,并初步用于Mhr体外感染,为研究Mhr等引起浆膜炎的病原与宿主的互作机制提供了体外细胞模型。

褪黑素对人腹膜间皮细胞上皮-间质转化的作用及机制

目的探讨褪黑素对人腹膜间皮细胞上皮-间质转化(EMT)的作用及机制。方法培养人腹膜间皮细胞株HMrSV5,构建核心蛋白聚糖(DCN)过表达和敲减质粒。将细胞分为正常对照组、TGF-β1组、TGF-β1+褪黑素组、TGF-β1+褪黑素+siDCN组、TGF-β1+褪黑素+siNC组、TGF-β1+DCN组。采用CCK-8法检测细胞增殖存活率;采用蛋白免疫印迹和实时定量PCR检测DCN、TGF-β1、Smad2、E-cadherin蛋白和mRNA表达水平。结果CCK-8结果显示,TGF-β1+褪黑素组、TGF-β1+褪黑素+siDCN组、TGF-β1+DCN组细胞存活率均较TGF-β1组高,TGF-β1+褪黑素组较TGF-β1+褪黑素+siDCN组细胞存活率更高(均P<0.05)。蛋白免疫印迹及实时定量PCR表明,TGF-β1组较对照组DCN和E-cadherin表达明显下调,TGF-β1+褪黑素组与TGF-β1+褪黑素+siDCN组较TGF-β1组DCN、E-cadherin蛋白及mRNA表达上调,TGF-β1、Smad2蛋白及mRNA表达下调;TGF-β1+褪黑素组较TGF-β1+褪黑素+siDCN组进一步上调E-cadherin、DCN蛋白及mRNA表达,进一步下调TGF-β1、Smad2蛋白及mRNA表达(均P<0.05)。结论褪黑素可延缓人腹膜间皮细胞EMT进程,DCN基因可能是抑制该细胞发生EMT的一个重要靶点。

骨髓间充质干细胞对腹膜间皮细胞凋亡的影响

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对高糖腹透液(PDF)诱导的大鼠腹膜间皮细胞(PMCs)凋亡的影响及可能作用机制。方法提取并鉴定大鼠原代BMSCs及PMCs,使用高糖腹透液诱导PMCs凋亡,收集BMSCs培养24 h后的细胞上清液作为条件培养基(BMSCs-CM)或通过Transwell小室将PMCs与BMSCs共培养。将PMCs分为空白对照(CON)组、高糖腹透液(PDF)组及间充质干细胞处理(PDF+BMSCs-CM)组,采用CCK-8法测定各组PMCs的增殖活力;JC-1法测定线粒体膜电位的去极化情况;TUNEL染色检测细胞凋亡情况;Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的胱天蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)和通路相关蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Raf)、丝裂原活化细胞外信号调节激酶(MEK)、细胞外信号调节激酶(ERK)及其磷酸化蛋白的表达水平。结果与CON组比较,PDF组PMCs增殖活力、线粒体膜电位水平降低,而凋亡率、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3、p-Raf/Raf、p-MEK/MEK、p-ERK/ERK比值升高(P<0.05);与PDF组比较,PDF+BMSCs-CM组PMCs增殖活力、线粒体膜电位升高,而凋亡率、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3/Caspase-3、p-Raf/Raf、pMEK/MEK、p-ERK/ERK比值降低(P<0.05)。结论BMSCs可减轻高糖腹透液诱导的PMCs凋亡,其机制可能与抑制Raf/MEK/ERK信号通路的活化有关。

骨髓间充质干细胞来源外泌体抑制高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT

目的探讨骨髓间充质干细胞外泌体(BMSCs-Exo)对高糖腹膜透析液(PDF)作用下人腹膜间皮细胞系(HMrSV5)发生上皮-间充质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法采用透射电镜、纳米颗粒追踪分析仪和Western blot对BMSCs-Exo进行鉴定;将HMrSV5细胞进行分组:(1)对照组;(2)不同浓度PDF(1.5%、2.5%、4.25%)组;(3)siNLRP3组;(4)siNC组;(5)BMSCs-Exo组。Western blot检测EMT标志物及NLRP3炎性体通路蛋白的表达,RT-qPCR检测mRNA表达,ELISA检测细胞上清中炎性因子表达量。结果BMSCs-Exo呈双层膜结构的圆形囊泡,直径40~150 nm,外泌体特异标记物CD9、CD81、TSG101和Alix阳性;与对照组相比,PDF组细胞中α-SMA、vimentin、NLRP3、pro-caspase-1及pro-IL-1β表达明显上调,而E-cadherin表达下调(P<0.05);PDF组细胞上清中TGF-β1、IL-1β和IL-18表达量显著提高(P<0.05)。siNLRP3组细胞α-SMA表达下降,而E-cadherin表达明显上调。与4.25%PDF组比较,BMSCs-Exo组细胞E-cadherin表达上调,而vimentin、α-SMA、NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达下调(P<0.05);ELISA结果显示,BMSCs-Exo可下调4.25%PDF诱导的细胞上清IL-1β、IL-18、TGF-β1的水平(P<0.05)。结论高糖PDF通过激活NLRP3炎性体信号途径诱导腹膜间皮细胞EMT,BMSCs-Exo可通过抑制该通路改善腹膜间皮细胞EMT。

LncRNA OIP5-AS1在高糖诱导的大鼠腹膜间皮细胞上皮-间质转分化中的作用

目的:腹膜纤维化是终末期肾病患者腹膜透析治疗引起的一种严重并发症。上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是早期腹膜纤维化的一个促成因素。本研究旨在探讨长链非编码RNA(LncRNA)OIP5-AS1在高糖培养的大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)中的作用及相关机制。方法:用OIP5-AS1 siRNA转染RPMC,然后用高糖(high glucose,HG)孵育。应用Transwell法测定RPMC的迁移能力。通过免疫荧光和α-SMA抗体评估RPMC的转分化能力。应用RT-qPCR分析OIP5-AS1、α-SMA、波形蛋白、E-钙黏蛋白、TGF-β_(1)、CTGF和Ⅰ型胶原的基因表达。结果:在HG孵育的RPMC中OIP5-AS1的表达升高。OIP5-AS1沉默降低了HG处理后RPMC的迁移能力,减弱了HG诱导的EMT和转分化。此外,OIP5-AS1沉默降低RPMC分泌的TGF-β_(1),并抑制TGF-β_(1)、CTGF和Ⅰ型胶原的mRNA表达。结论:LncRNA OIP5-AS1通过TGF-β_(1)途径调节EMT、转分化以及迁移。OIP5-AS1是一种新发现的LncRNA,可能与腹膜纤维化的EMT过程有关。

半夏泻心汤含药血清对胃癌细胞外泌体诱导的腹膜间皮细胞FN1、LAMC1表达及胃癌细胞与腹膜间皮细胞黏附、侵袭的影响

目的观察半夏泻心汤含药血清对胃癌细胞来源外泌体诱导的腹膜间皮细胞纤维连接蛋白1(FN1)和层粘连蛋白γ1(LAMC1)表达及胃癌细胞与腹膜间皮细胞黏附、侵袭的影响,探讨其抑制胃癌腹膜转移的作用机制。方法制备半夏泻心汤含药血清,提取人胃癌细胞NCI-N87外泌体,采用透射电镜观察及Western blot进行鉴定。将人腹膜间皮细胞HMrSV5分为正常对照组、模型组、5-氟尿嘧啶(5-FU)组和半夏泻心汤低、中、高剂量组,每组3个复孔,以NCI-N87细胞外泌体诱导HMrSV5细胞,并分别用10%含药血清培养,ELISA检测HMrSV5细胞上清液FN1和LAMC1含量,PCR检测HMrSV5细胞FN1和LAMC1mRNA表达,荧光酶标仪检测NCI-N87细胞与HMrSV5细胞黏附情况,Transwell小室检测NCI-N87细胞向HMrSV5细胞侵袭情况。结果透射电镜观察NCI-N87细胞外泌体呈椭圆或碟状囊泡结构,粒径介于40~80 nm,外泌体标志蛋白CD9、CD63高表达,钙网蛋白低表达。与正常对照组比较,模型组HMrSV5细胞上清液FN1和LAMC1含量明显增加,HMrSV5细胞FN1和LAMC1 mRNA表达明显升高,NCI-N87细胞和HMrSV5细胞黏附率明显升高,NCI-N87细胞向HMrSV5细胞侵袭数量明显增加(P<0.01);与模型组比较,半夏泻心汤含药血清干预72 h后,HMrSV5细胞上清液FN1和LAMC1含量减少,HMrSV5细胞FN1和LAMC1 mRNA表达降低,NCI-N87细胞和HMrSV5细胞黏附率降低,NCI-N87细胞向HMrSV5细胞侵袭数量减少,其中半夏泻心汤中、高剂量组差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论半夏泻心汤可降低胃癌细胞NCI-N87外泌体诱导的腹膜间皮细胞HMrSV5 FN1和LAMC1蛋白及mRNA表达,降低胃癌细胞与腹膜间皮细胞黏附和侵袭能力,可能是半夏泻心汤治疗胃癌腹膜转移的作用机制之一。

表没食子儿茶素没食子酸酯抑制人腹膜间皮细胞上皮-间质转化的作用及机制

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人腹膜间皮细胞(HPMCs)上皮-间质转化(EMT)的作用及机制。方法收集新开管的腹膜透析和腹膜透析1年以上患者的HPMCs,分别采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法和免疫印迹(Western blot)法检测紧密连接蛋白1(ZO-1)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、铁死亡抑制蛋白1(FSP1)mRNA和蛋白表达水平。采用HPMCs细胞系HMrSV5进行体外实验研究,分别加入20,40,60,80,100μg/mL EGCG,检测EGCG对HMrSV5的细胞毒性。通过200μg/mL和500μg/mL晚期糖基化终产物(AGEs)构建HPMCs EMT模型,将HMrSV5细胞分为对照组(AGEs造模前无处理)、实验组(AGEs造模前2 h加入EGCG共孵育)、si-NC+EGCG组(转染si-NC后,AGEs造模前2 h加入EGCG共孵育)、si-Notch3+EGCG组(转染si-Notch3后,AGEs造模前2 h加入EGCG共孵育),检测ZO-1,E-cadherin,FSP1,Notch3 mRNA和蛋白表达水平。结果与新开管的腹膜透析患者比较,腹膜透析1年以上患者HPMCs的ZO-1及E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均显著升高,FSP1及Notch3 mRNA表达水平均显著降低(P<0.05)。与正常HMrSV5比较,加入500μg/mL AGEs诱导HMrSV5后,ZO-1及E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均显著升高,FSP1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。与对照组比较,实验组ZO-1及E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均显著降低,FSP1及Notch3 mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与si-NC+EGCG组比较,si-Notch3+EGCG组Notch3及FSP1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低,ZO-1及E-cadherin mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。腹膜透析患者HPMCs中Notch3表达水平与ZO-1和E-cadherin呈负相关(r=-0.8477,-0.3822,P<0.05),与FSP1呈正相关(r=0.6626,P<0.05)。结论EGCG通过Notch3抑制AGEs诱导的HPMCs EMT,发挥对腹膜透析患者的保护作用。

大蒜素通过JAK2/STAT3信号通路改善高糖诱导的人腹膜间皮细胞-间充质转化

目的探讨大蒜素改善高糖诱导的人腹膜间皮细胞-间充质转化的相关机制。方法培养人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)后将其进行两次分组,分组1:①对照组;②8.5 mmol/L D-葡萄糖诱导组(8.5 mmol/L DG组);③17 mmol/L D-葡萄糖诱导组(17 mmol/L DG组);④34 mmol/L D-葡萄糖诱导组(34 mmol/L DG组);⑤68 mmol/L D-葡萄糖诱导组(68 mmol/L DG组)。其中除对照组外,其余组分别用8.5、17、34、68 mmol/L的D-葡萄糖诱导48 h。分组2:①对照组;②34 mmol/L D-葡萄糖诱导组(HG组);③34 mmol/L D-葡萄糖+低剂量大蒜素诱导组(AL-L组);④34 mmol/L D-葡萄糖+中剂量大蒜素诱导组(AL-M组);⑤34 mmol/L-葡萄糖+高剂量大蒜素诱导组(AL-H组);⑥34 mmol/L D-葡萄糖+JAK2抑制剂诱导组(JAK2组)。其中HG组用34 mmol/L的D-葡萄糖诱导48 h,AL-L组、AL-M组、AL-H组用34 mmol/L的D-葡萄糖预处理6 h后分别用10、20和40 ng/mL大蒜素诱导48 h,JAK2组加入1μmol/L AG490预处理6 h后用34 mmol/L的D-葡萄糖诱导48 h。ELISA检测HPMCs上清的IL-6、TNF-α和IL-1β的含量;CCK-8检测细胞增殖并观察形态;Western blot检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、α-SMA、MCP-1、p65、p-p65蛋白的表达情况。结果与对照组相比,高糖诱导组HPMCs的相对存活率明显降低(P<0.01),细胞形态表现异常,促进上皮细胞-间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发生的α-SMA、N-cadherin和Vimentin表达明显上调,抑制EMT发生的E-cadherin蛋白表达明显下调,JAK2/STAT3信号通路被激活从而导致EMT的发生(P<0.01);而大蒜素能明显促进高糖诱导后的HPMCs增殖,恢复异常的细胞形态,调节与EMT发生的相关蛋白水平从而改善HPMCs的上皮间质转分化;与高糖诱导组相比,大蒜素处理组HPMCs的促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α明显降低,促炎症蛋白p-p50和MCP1表达明显下调,表明大蒜素能改善EMT引起的炎症。结论大蒜素可通过抑制JAK2/STAT3信号通路调节EMT发生的标志蛋白、炎症信号蛋白及炎症因子水平从而改善高糖诱导的EMT及炎症。

维生素E对高糖诱导人腹膜间皮细胞纤维连结蛋白表达及活性氧生成的影响

持续不卧床腹膜透析（CAPD）是目前治疗终末期肾病（ESRD）的主要替代治疗方法之一,以往的研究已表明高糖可导致腹膜间皮细胞损伤,细胞外基质产生增多,最终导致腹膜纤维化。高糖引起腹膜纤维化的机制至今尚未阐明。氧化应激（OS）是指由于促氧化与抗氧化系统两者平衡失调导致活性氧（ROS） 过度产生造成的组织损伤。研究已经证实腹膜透析患者普遍存在氧化应激。

川芎嗪对腹膜间皮细胞CD40表达的影响

目的 :探讨川芎嗪对腹膜间皮细胞CD4 0表达的影响。方法 :分离、培养大鼠腹膜间皮细胞 ,分别用 4 2 5 %腹透液、4 2 5 %腹透液加γ 干扰素 (IFN γ ,10 0u/ml)、4 2 5 %腹透液加川芎嗪 4 0mg/L、4 2 5 %腹透液加IFN γ 10 0u/ml加川芎嗪 4 0mg/L刺激细胞 30min ,以DMEM /F12培养基为对照组。通过逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)及流式细胞仪 (FACS)检测间皮细胞CD4 0表达。结果 :4 2 5 %腹透液刺激后腹膜间皮细胞CD4 0mRNA及其蛋白的表达明显高于对照组 (P <0 0 1) ;4 2 5 %腹透液加IFN γ联合刺激后 ,间皮细胞CD4 0mRNA及其蛋白的表达明显高于对照组及单纯 4 2 5 %腹透液组 (P <0 0 1)。加入川芎嗪后 ,可显著减低单纯 4 2 5 %腹透液及 4 2 5 %腹透液加IFN γ引起的CD4 0mRNA及其蛋白的高表达 (P <0 0 1)。结论 :单纯腹透液及腹透液加IFN γ可显著增加腹膜间皮细胞CD4 0的表达 ,而川芎嗪对腹膜间皮细胞CD4 0的表达有显著的抑制作用。在长程腹膜透析 (CAPD)过程中 ,加入川芎嗪可能有助于减轻透析液引起的慢性炎症反应 ,从而防止或延缓腹膜纤维化的发生。

高糖对人腹膜间皮细胞的增殖和损伤及分泌细胞因子的影响

目的:探讨高糖介导腹膜纤维化的可能机制。方法:原代培养的第3代人腹膜间皮细胞(HPMCs)分为不同时间(24,48h)的对照组(F12)和高糖组(F12+4%葡萄糖)。用MTT法测定细胞增殖,乳酸脱氢酶(LDH)法观察细胞损伤程度,采用酶联免疫法(ELISA)测定纤维连接蛋白(FN)、转化生长因子β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)蛋白水平以及采用RT-PCR测定FN,TGF-β1和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)mRNA表达。结果:①高糖明显抑制细胞增殖,24h和48h高糖组与同一时间点对照组比较,MTT吸光度值均明显下降(P<0.001或P<0.01);②高糖明显导致细胞损伤,24h和48h高糖组与同一时间点对照组比较,培养液中LDH含量均明显增加(均P<0.001);③高糖培养24,48h均使FN,CTGF和TGF-β1蛋白表达增加(P<0.05或P<0.001);④高糖使FN,TGF-β1和PAI-1mRNA表达均上调。结论:高糖能够抑制HPMCs增殖,损伤HPMCs,并刺激HPMCs分泌更多的TGF-β,CTGF,FN和PAI-1,从而使HPMCs细胞外基质生成增多、降解减少,最终导致腹膜纤维化的形成。

人腹膜间皮细胞的培养及特征

目的 :建立人腹膜间皮细胞 (HPMC)培养模型 ,检测HPMC细胞外基质蛋白及白细胞介素 (IL - 8)的表达。方法 :采用胰蛋白酶 -EDTA消化法 ,从人的腹膜组织中分离HPMC。采用形态学和链霉菌抗生物素蛋白 过氧化物酶连接法 (即SP法 ) ,对培养细胞进行鉴定。采用SP法检测HPMC纤维连接蛋白 (FN)、胶原Ⅲ和胶原V及转化生长因子 (TGF) β1表达。采用逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)检测HPMCIL - 8mRNA和FNmRNA的表达。结果 :光镜示细胞融合后呈多边形 ,超微结构下可见丰富的微绒毛和内质网 ,免疫组化染色结果示HPMC可表达角蛋白 ,波形蛋白 ,胶原Ⅲ ,FN ,TGFβ1蛋白 ,Ⅷ因子、胶原V表达阴性。人腹膜间皮细胞亦表达FNmRNA和IL - 8mRNA。结论 :HPMC培养模型的建立 ,可为进一步研究腹膜纤维化的防治及IL - 8在腹膜透析中的作用提供理论依据。

黄芪对TGF-β1致人腹膜间皮细胞分泌细胞外基质的影响

目的 :探讨黄芪对腹膜纤维化的作用及可能机制。方法 :人腹膜间皮细胞 (HPMC)作体外培养 ,在第三代 ,将细胞转板至细胞融合后 ,将其分为对照组 (F12 ) ,TGF β1组 (F12 +TGF β15ng/ml) ,TGF β1加黄芪 1组(F12加TGF β1加黄芪 ,黄芪终浓度为 10 0 μg/ml,TGF β1加黄芪 2组 (F12加TGF β1加黄芪 ,黄芪终浓度为 1mg/ml) ,分别在 2 4,48h采用ELISA法检测上清液中纤维连接蛋白 (FN)和纤溶酶原抑制剂 (PAI 1)的含量 ;FNmRNA ,PAI 1mRNA和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)mRNA的表达采用半定量逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)检测。结果 :①HPMC表达FN ,PAI 1和bFGF ;②HPMC在 5ng/mlTGF β1刺激下分泌FN及PAI 1明显的增加 ,与对照组比较差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ;③HPMC在TGF β1和不同浓度的黄芪刺激后 ,在 2 4h内可使FN及PAI 1减少 ,尤其是PAI 1与TGF β1组比差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。④HPMC经TGF β1作用 12h后 ,FNmRNA ,PAI 1mRNA和bFGFmRNA半定量结果与对照组相比 ,其表达量分别上调 18.5 4%,8.6 %和 6 6 .9%,HPMC经 10 0μg/ml和 1mg/ml黄芪作用 12h后FN ,PAI 1和bFGFmRNA的表达与TGF β1组比较均下调 ,其结果分别为5 .3 %,1.3%,3 .8%和 5 .4%,74.3 %,2 3 .7%。结论 :TGF β1可促进HPMC合成?

氧化应激在腹膜纤维化大鼠模型腹膜间皮细胞转分化中的作用(英文)

目的:研究氧化应激在腹膜纤维化大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用;观察抗氧化剂普罗布考的干预效应。方法:采用4.25%高糖腹透液以100mL/kg腹腔注射法复制腹膜纤维化大鼠模型,实验分为正常对照组、生理盐水对照组、腹膜纤维化模型组和普罗布考干预组。4周后行腹膜平衡试验,处死大鼠,准确测量超滤量,检测腹膜功能;取肠系膜组织匀浆后测定氧化应激指标丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量;留取壁层腹膜组织行HE及Masson染色,并测量腹膜厚度;采用免疫组织化学和Western印迹检测大鼠壁层腹膜组织腹膜间皮细胞转分化指标E-cadherin蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达。结果:腹膜纤维化模型组大鼠腹膜间皮细胞脱落,与正常对照组比较,壁层腹膜厚度和肠系膜匀浆MDA含量增加(P<0.01),腹腔超滤量和GSH-Px活性降低(P<0.01);转分化指标α-SMA蛋白表达明显上调(P<0.01),E-cadherin蛋白显著下调(P<0.01)。普罗布考干预组间皮细胞基本完好,与纤维化模型组比较,壁层腹膜厚度和肠系膜匀浆MDA含量降低(P<0.01),腹腔超滤量(P<0.05)和GSH-Px活性(P<0.01)上升;腹膜α-SMA蛋白表达明显下调(P<0.01),E-cad-herin蛋白表达明显上调(P<0.01)。结论:氧化应激在高糖腹透液诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化中起一定作用;普罗布考可改善腹膜纤维化大鼠模型腹膜结构和功能,部分逆转腹膜间皮细胞转分化。

黄芪甲苷对高糖腹膜透析液诱导人腹膜间皮细胞表达致纤维化因子的影响

目的观察黄芪甲苷对高糖腹膜透析液(PDS)诱导人腹膜间皮细胞(HPMCs)结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨黄芪甲苷对致纤维化因子的调节作用。方法选用HMrSV5细胞株,培养至第5代,随机分为对照组(10%FBS培养液)、模型组(4.25%PDS和10%FBS培养液)和黄芪甲苷低、中、高剂量组(含黄芪甲苷终浓度为10、20、40μg/mL的4.25%PDS和10%FBS培养液)。采用MTT法检测细胞活性,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液TGF-β1、CTGF、VEGF水平。结果除5μg/mL浓度组外,HPMCs的活性均较空白组不同程度增强,以40、45、50μg/mL浓度组作用较显著(P<0.05);与空白组比较,模型组TGF-β1、CTGF、VEGF表达增加;与模型组比较,黄芪甲苷各组TGF-β1、CTGF、VEGF表达明显减少,呈量效关系(P<0.05)。结论黄芪甲苷通过减少高糖刺激下HPMCs TGF-β1、CTGF、VEGF表达,达到延缓腹膜纤维化的发展。

肾康注射液对CAPD小鼠腹膜间皮细胞的保护作用及机制研究

目的探讨肾康注射液对连续性不卧床腹膜透析(CAPD)小鼠腹膜间皮细胞(PMCs)的保护作用及可能机制。方法 40只ICR小鼠均分为空白对照(A)组,阳性对照腹透(B)组(2.5%腹透液),低(C)、中(D)、高(E)剂量肾康干预组(2.5%腹透液+5、10及20 mL/kg肾康注射液),观察至4周。采用生化法检测空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油、C-反应蛋白(CRP)水平;采用酶联免疫吸附试验检测血清及透出液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)水平;HE染色观察腹膜组织病理改变;分别以免疫组化染色和Real-time PCR检测腹膜组织中TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的蛋白质表达和m RNA转录水平。结果各组小鼠体质量、空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油水平差异无统计学意义。与B组比较,C、E组差异均无统计学意义,但D组CRP水平显著减低,无论是血清还是腹腔透出液中,C、D组TNF-α、TGF-β1、VEGF及CTGF表达水平均降低,而E组TNF-α、TGF-β1升高(P<0.05),但E组VEGF及CTGF差异均无统计学意义。与E组比较,除C组腹腔液中CTGF差异无统计学意义外,血清及腹腔透出液中C、D组TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF均降低(P<0.05)。B组可见腹膜间皮细胞均有损害;C、D、E组有不同程度改善。与B组比较,C、D、E组TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF蛋白及m RNA水平呈逐渐降低趋势(P<0.05)。结论一定浓度的肾康注射液可通过抑制CAPD小鼠PMCs的TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的表达,保护PMCs,从而控制腹膜纤维化的发生发展。

腹透液相关浓度葡萄糖对体外腹膜间皮细胞的影响(英文)

目的研究腹透液相关的三种浓度葡萄糖(1.5%、2.5%、4.25%)对体外培养的腹膜间皮细胞凋亡及其形态的影响。方法胰蛋白酶消化法从腹膜组织中分离间皮细胞,建立体外培养模型。采用Hoechst33258荧光染色法及流式细胞仪技术测定体外培养的腹膜间皮细胞在腹膜透析液相关浓度葡萄糖作用下的凋亡率;采用透射电子显微镜技术观察高浓度葡萄糖对体外培养的腹膜间皮细胞形态学的影响。结果Hoechst33258荧光染色法和流式细胞仪结果显示:与对照组比较,1.5%、2.5%、4.25%葡萄糖均能引起明显的腹膜间皮细胞的凋亡(P<0.05),三种浓度葡萄糖组间也有显著的差异(P<0.05),4.25%甘露醇能引起明显的凋亡(P<0.01),4.25%葡萄糖与4.25%甘露醇比较,前者能引起明显的凋亡(P<0.05);与正常对照组比较,1.5%葡萄糖分别作用于腹膜间皮细胞24h、72h、120h,各时间组均出现明显的凋亡(P<0.05)。腹膜间皮细胞的凋亡率与葡萄糖浓度和作用时间呈正相关(r>0.7,P<0.05)。透射电子显微镜观察4.25%葡萄糖作用72h后大鼠腹膜间皮细胞的形态变化:细胞表面的微绒毛倒伏、脱失;细胞质内出现线粒体空泡样变;细胞核内的染色质浓缩、边集;出现凋亡小体。结论腹膜透析液相关的三种浓度葡萄糖和4.25%的甘露醇均能引起腹膜间皮细胞的凋亡;葡萄糖诱导的腹膜间皮细胞凋亡具有浓度和时间依赖性;葡萄糖引起的细胞凋亡不仅与其渗透压有关,还与葡萄糖代谢有关;葡萄糖引起的细胞形态改变有:腹膜间皮细胞表面的微绒毛倒伏、缺失;细胞质内的线粒体出现空泡样变;细胞核内出现染色质浓缩、边集的改变。

高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β的影响

目的:观察高糖腹膜透析液对人腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β的影响。方法:体外培养人腹膜间皮细胞株第5~10代[HMr SV5,DMEM/F12培养基含10%(体积分数)胎牛血清],观察1.5%、2.5%、4.25%(质量分数)葡萄糖腹膜透析液(dextrose)及线粒体呼吸链复合酶Ⅰ抑制剂鱼藤酮(rotenone),线粒体呼吸链复合酶Ⅱ抑制剂噻吩甲酰三氟丙酮(thenoyltrifluoroacetone,TTFA),线粒体呼吸链复合酶Ⅲ抑制剂抗霉素A(antimycin A)对细胞IL-1β表达的影响(免疫印迹);通过小RNA干扰技术下调NLRP3的表达,免疫印迹分析4.25%高糖腹膜透析液作用下细胞IL-1β的表达;通过白藜芦醇(resveratrol,RSV)诱导自噬,3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、自噬相关蛋白5(autophagy related gene 5,ATG5)siRNA、自噬相关蛋白(Beclin1)siRNA抑制自噬,流式细胞仪分析细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS),免疫印迹分析IL-1β的表达。结果:对照组、1.5%高糖腹膜透析液、2.5%高糖腹膜透析液、4.25%高糖腹膜透析液、鱼藤酮(10μmol/L)、抗霉素A(50 mg/L)、噻吩甲酰三氟丙酮(10μmol/L)各组细胞上清IL-1β的相对表达依次为0、0.175±0.082、0.418±0.163、2.357±0.288、2.642±0.358、3.271±0.462、0.123±0.091,提示2.5%高糖腹膜透析液、4.25%高糖腹膜透析液、鱼藤酮、抗霉素A作用细胞IL-1β表达明显升高,应用NLRP3 siRNA可阻断上述效应;此外,对照组、阴性对照siRNA(negative control,NC siRNA)、RSV(50μmol/L,诱导自噬)、3-MA(10 mmol/L,抑制自噬)、ATG5 siRNA(抑制自噬)、Beclin1 siRNA(抑制自噬)各组总线粒体荧光强度分别为1.76±0.42、1.83±0.55、1.85±0.62、7.36±0.92、5.35±0.77、5.06±0.62,超氧化线粒体荧光强度分别为821.68±95.12、868.15±102.82、723.39±92.56、1 660.08±113.65、1 433.01±107.24、1 562.36±112.88,结合免疫印迹结果,提示抑制自噬可增强线粒体ROS产生和提高IL-1β表达,诱导自噬对ROS、IL-1β无明显影响。结论:长期应用高糖腹膜透析液,腹膜间皮细胞NLRP3-IL-1β持续激活,实时启动自噬可能成为干预NLRP3-IL-1β持续激活、延缓腹膜透析腹腔慢性炎症及腹膜纤维化的治疗靶点。

Troglitazone对人腹膜间皮细胞TGF-β_1和纤维连接蛋白表达的影响

目的:研究过氧化物增生体激活受体γ(PPAR-γ)激动剂troglitazone(曲格列酮,TGZ)对高浓度葡萄糖刺激下体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMCs)中TGF-β1和细胞外基质纤维连接蛋白(Fn)表达的影响。方法:采用胰蛋白酶消化法从人大网膜组织中分离间皮细胞,建立稳定的体外培养模型。根据细胞增殖与毒性实验选择troglitazone的最佳浓度15μmol/L,干预高浓度葡萄糖(30mmol/LD-葡萄糖)刺激下的人腹膜间皮细胞。采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)半定量检测HPMCs中PPAR-γ,TGF-β1以及Fn的 mRNA表达;采用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测HPMCs培养液中TGF-β1蛋白质水平;Western印迹检测Fn蛋白质水平。结果:高糖(30mmol/LD-葡萄糖)刺激可在 mRNA和蛋白质水平明显上调HPMCs表达TGF-β1和Fn(P<0.01),troglitazone干预高糖孵育的HPMCs,可使TGF-β1和Fn mRNA和蛋白质的表达明显下调(P<0.05)。结论:Troglitazone能够明显抑制在高糖刺激下的HPMCsTGF-β1和Fn的表达,这可能为临床防治长期腹膜透析患者的腹膜纤维化提供一种较为有效的方法。