犬贾第鞭毛虫PDI-4基因的表达及定位

目的克隆、表达二硫键异构酶4基因,并研究其在犬贾第鞭毛虫滋养体中的定位。方法根据GenBank登陆的贾第鞭毛虫二硫键异构酶4基因(gPDI-4)(登录号XM_001710176)序列,通过分析序列,设计合成一对gPDI-4引物。以犬贾第鞭毛虫滋养体总RNA为模板,采用反转录PCR的方法扩增PDI-4基因并克隆至pMD-18T载体,构建pMD-gPDI-4载体,再把目的基因亚克隆至pET-28a载体,构建表达载体pET-gPDI-4,转化入大肠埃希菌表达菌DE3中,经IPTG诱导后用SDS-PAGE分析表达情况。同时用组氨酸(His)结合树脂柱纯化PDI-4蛋白。用纯化的PDI-4蛋白免疫小鼠,之后收集血清作为一抗,通过免疫荧光法检测PDI-4在贾第鞭毛虫滋养体中的定位。结果反转录PCR(RT-PCR)扩增出大小为1 065bp的PDI-4基因,构建的pET-gPDI-4能高效表达gPDI-4蛋白,SDS-PAGE显示表达蛋白分子质量为36ku。免疫荧光试验显示贾第鞭毛虫PDI-4蛋白除定位于细胞表面、内质网和腹部吸盘外,主要存在于腹部鞭毛。结论成功克隆、表达了犬贾第鞭毛虫PDI-4基因,并确定其主要在腹鞭毛表达。